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研究背景植物乳杆菌是乳杆菌属中含有天然质粒最为丰富和最为多样的菌种,也是研究乳杆菌属的模式菌株。这些质粒很可能在植物乳杆菌的生长、发育、遗传和进化中发挥着重要作用,所以丰富的天然质粒可以促进植物乳杆菌属的研究并提供理想的研究对象。从中国四川泡菜中检出的植物乳杆菌PC518菌株中包含有多个质粒,本课题组已经分析和发表了其中两个质粒,滚环复制的质粒pLP18和theta复制的质粒pLP60,而本研究则发现了另外两个新质粒。一个质粒是通过滚环复制的质粒,另一个质粒是通过theta复制的质粒。全面分析新质粒的序列及其所携带的遗传学研究信息,不仅增加了天然质粒数据库的数量,而且对植物乳杆菌的分子生物学研究具有重要的意义。全基因组测序可以实现对乳杆菌菌株基因组间变异信息的全面扫描,同时可以一次性开发出大量的基因标记。福菜乳杆菌也属于乳杆菌属,而本文分析了一株分离自台湾福菜中的潜在的益生菌福菜乳杆菌Y97的全基因组序列,为下一步与本课题组从重庆泡姜中分离的福菜乳杆菌重庆亚种CQ16Z1菌株进行对比和研究提供理论基础。目的1.提取并检出植物乳杆菌PC518菌株中的新质粒;2.对新质粒进行序列分析和生物学特性的分析;3.福菜乳杆菌Y97的全基因组序列分析。材料与方法1.采用本课题组改良后的方法来提取植物乳杆菌PC518菌株的质粒,并通过建立质粒DNA文库、反向PCR和NCBI数据库中的BLAST比对工具来检出新质粒。2.利用Snap Gene Viewer、Mega X、DNA Man和Primer 5等软件与NCBI数据库中的工具和网站,如BLAST(htty://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和寻找开放阅读框(ORF)的网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)等,分析其复制方式、ORF、酶切位点和复制机制等特点。3.培养、收集福菜乳杆菌Y97的菌体,将菌体送至北京华大基因科技有限公司进行全基因组序列测序。结果1.在植物乳杆菌PC518菌株中检出两个新质粒,一个是质粒pLP325,另一个是质粒plp75TA。2.质粒pLP325属于滚环复制pC194家族,编码了2个ORF,分别是复制蛋白(Rep)和移动蛋白(Mob)。质粒pLP325在nick位点的上、下游均有反向重复序列,在收集了43个pC194家族的质粒后,对他们进行多序列比对和Rep蛋白的聚类分析,发现pC194家族的质粒dso的bind位点总是以反向重复序列为特征,可能位于nick位点的上游,也可能位于nick位点的下游。而43个pC194家族的宿主属于7个属的21个种。3.质粒plp75TA是theta复制的质粒,属于RepA_N家族。编码了10个ORF,一个复制蛋白,一个移动蛋白,两个毒素,一个抗毒素和一个DNA结合的螺旋-转角-螺旋转录调节因子,一个位点特异性整合酶,另外三个ORF编码的假定蛋白和释放酶的功能无法从GenBank数据库中推断出来。在质粒plp75TA的毒素和抗毒素系统及位点特异性整合酶(TAI)的两端发现有一对同向重复序列。收集了61个含有TAI的质粒,并且其查询覆盖率和相似性均大于95%,但只有56个质粒能共同建立Rep蛋白的系统进化树。Rep蛋白通过系统进化树聚类于7个进化群,群与群之间质粒的相似性不同,最高的相似性为71.13%,查询覆盖率为91%,最低的为0。56个质粒的宿主范围属于乳杆菌属和片球菌属。在质粒plp75TA的毒素和抗毒素系统及位点特异性整合酶的上游还有一个毒素及DNA结合的螺旋-转角-螺旋转录调节因子(TAITR),在他们的两端未发现有同向重复序列或者反向重复序列。收集了22个含有TAITR且覆盖率和相似性均大于95%的质粒,只有21个质粒能通过Rep蛋白共同建立系统进化树。系统进化树将Rep聚类于4个进化群,进化群3中的质粒pPL2022-1与进化群4中的质粒pL11995-7的相似性为66.67%,但其查询覆盖率仅仅为1%。这21个质粒的宿主范围只属于乳杆菌属。4.福菜乳杆菌Y97的基因组是由一个2.56 Mb的染色体和三个质粒组成。三个质粒的大小分别是37,880 bp、27,087 bp和25,584 bp。基因组包含2 622个基因,基因全长2,306,070 bp,占全基因组的87.06%。串联重复序列数量为71条,串联重复序列总长度是4 575 bp,占基因组的0.1727%。预测了43个小卫星DNA、3个微卫星DNA、56个tRNA、12个rRNA和7个sRNA。结论1.通过对属于pC194家族的质粒pLP325的分析发现,其bind位点的位置可能不同于以往认为其只固定于下游的观点,本文提出了一个新观点,即bind的位置不固定,可能位于nick位点的上游,也可能位于nick位点的下游,总以反向重复为特征。这为bind位点的位置提供了新的观点。pC194家族的宿主范围比较狭窄。2.通过对质粒plp75TA序列的分析表明,质粒plp75TA属于theta复制的质粒。通过对质粒plp75TA的TAI和TAITR分析,发现TAI和TAITR可以在质粒之间进行转座。根据推测,像TAI和TAITR这样能转座的TA系统会削弱或失去维持质粒遗传稳定性的能力。3.通过对福菜乳杆菌Y97进行全基因组序列分析,发现该菌含有一个染色体和三个质粒,而提供的基因组信息能与本课题组研究的福菜乳杆菌重庆亚种菌株进行对比,有助于进一步研究福菜乳杆菌重庆亚种CQ16Z1菌株。