【摘 要】
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1,2,4-丁三醇（1,2,4-butantriol,BT）是一类非天然四碳多元醇,应用于军工、医药、化妆品等领域。前期课题组通过异源表达木糖脱氢酶和脱羧酶构建了BT合成途径,并通过对木糖和BT分支代谢途径弱化、高效脱羧酶筛选、葡萄糖效应相关基因缺失等获得了一株重组大肠杆菌（Escherichia coli）,但发现中间代谢物木糖酸的积累会影响菌体生长。本研究通过不同启动子强化末端基因表达及启动子
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1,2,4-丁三醇（1,2,4-butantriol,BT）是一类非天然四碳多元醇,应用于军工、医药、化妆品等领域。前期课题组通过异源表达木糖脱氢酶和脱羧酶构建了BT合成途径,并通过对木糖和BT分支代谢途径弱化、高效脱羧酶筛选、葡萄糖效应相关基因缺失等获得了一株重组大肠杆菌（Escherichia coli）,但发现中间代谢物木糖酸的积累会影响菌体生长。本研究通过不同启动子强化末端基因表达及启动子组合优化BT合成途径基因表达以平衡木糖酸积累,强化糖酵解途径以改善菌体生长等策略提高了BT产量。为考察重组的基因表达对BT合成途径各反应的影响及为构建平衡木糖酸的BT合成工程菌做准备,敲除内源性脱水酶基因yjh G和醇脱氢酶基因yqh D构建缺陷菌株,结果显示与原产BT菌株E.coli KXW3009相比,缺陷菌株E.coli KXW3010中木糖酸累积增加23.4%,生物量减少41.7%,BT产量明显下降。鉴于yjh G是参与BT合成的主要基因,为便于研究优化末端基因yqh D表达策略,游离表达Yjh G,菌株木糖酸减少12.1%,生物量增加19.2%,BT为7.1 g·L-1。基于此,利用不同启动子Pyqh D、Ptac、Pinv、Pdna KJ及Pgrp E优化Yqh D表达,其中启动子Pinv游离表达基因yqh D构建的E.coli KXW3010P3,其Yqh D酶活提高43.1%,缓解了木糖酸积累促进BT合成,BT达到14.4 g·L-1。受限于内源木糖酸脱水酶Yjh G活性,使得木糖酸积累(4.3 g·L-1)。替换强启动子Ptac调整脱氢反应并以强启动子Ptac、Prrn CP1和Prrn H P1强化脱水反应以平衡中间代谢物木糖酸积累,结果发现启动子Prrn H P1游离表达提高了Yjh G表达,木糖酸减少27.9%,生物量增加7.9%,BT产量达到15.6 g·L-1,木糖摩尔转化率增加13.3%。此外,进一步过表达葡萄糖激酶Glk和6-磷酸果糖激酶Pfk增强糖酵解途径,菌体生物量提高13.8%,BT产量为17.3 g·L-1,增加10.9%。对重组菌株在5 L发酵罐中的发酵情况进行考察。当装液量为3.0 L,接种量为15%,在27 h时一次性定量补加碳氮源,菌株E.coli KXW3010P3-41-GF的BT产量达到25.8 g·L-1。另外,该重组菌株实现了以木质纤维素为原料合成BT,为降低工业化生产BT的成本提供了一种新策略。
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