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miRNA为一类非编码小RNA，约22nt的单链核苷酸，能够通过转录后调控抑制靶基因的表达，进而参与各种生命活动。在细胞核中，miRNA最初由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录生成原初转录物pri-miRNA，然后由核糖核酸酶Ⅲ Drosha和DGCR8（DiGeorge cirtical region8）构成的复合物microprocessor进行识别切割，生成约60-70nt的前体miRNA（pre-miRNA）。Exportin-5识别pre-miRNA上约2nt的3’突出末端，通过Ran-GTP依赖机制将pre-miRNA转运至细胞质[1][2]。在细胞质中，另一个核糖核酸酶Ⅲ Dicer将pre-miRNA切割成22nt的miRNA双链，即miRNA/miRNA*。通常双链中有一条链（即miRNA）生成成熟的miRNA指导链，选择性与AGO家族的蛋白结合形成miRISC，作用于靶mRNA的3’UTR，从而导致靶基因mRNA的降解或通过降低靶基因的稳定性从而抑制靶基因翻译，降低靶基因蛋白的表达水平。而另一条链miRNA*通常被降解。在不同细胞、组织、器官的生长发育过程中，miRNA的表达谱有很大差异。它们与许多生理病理过程密切相关，如生长发育、细胞分化、细胞凋亡、脂类代谢、激素分泌、肿瘤形成和病毒感染等[3][4][5]。一个特异的miRNA可以靶向几百个靶基因，而一个靶基因也可以由不同的miRNA进行调控。最近，众多报导显示，miRNA能够影响细胞的多种功能，并参与人类癌症的发生发展。在肿瘤细胞中miRNA的表达水平普遍较低，miRNA在肿瘤细胞中可以作为癌miRNA或者抑癌miRNA出现，而miR-138通常作为抑癌miRNA发挥生物学功能。目前，研究miR-138功能主要聚焦在肿瘤发生发展及转移、细胞分化、DNA损伤以及疾病相关性等方面。在世界范围内，子宫颈癌居女性恶性肿瘤的第二位；在女性与肿瘤相关的死因中，子宫颈癌亦居第二位。目前，通过检测子宫颈癌的miRNA表达谱，试图从中寻找特异的生物标志物的方法已成为子宫颈癌治疗的方向之一。具体方法为研究特异miRNA及其功能性靶基因与子宫颈癌的发生发展的关系，从而找到可供治疗的关键潜在靶标分子。文献报道，在宫颈癌HeLa细胞中，仅存在miR-138的前体miRNA，而几乎检测不到miR-138成熟体，提示miR-138可能与子宫颈癌的发生发展相关联。本论文的研究目的在于过表达miR-138并检测其在HeLa细胞中的生物学意义。寻找及鉴定miR-138的靶基因，并进一步研究其在HeLa细胞中的生物学功能。研究内容分为以下四方面：1.miR-138靶向RMND5A的预测及验证。通过生物信息学软件TargetScan5.2预测miR-138的最高分值靶基因为RMND5A，然后通过双荧光素酶报告基因实验验证了miR-138对RMND5A3’UTR的两个靶位点具有直接抑制作用，在HeLa细胞中转染miR-138mimics也导致RMND5A基因的mRNA和蛋白水平下降，以上结果说明，miR-138能够直接靶向RMND5AmRNA的3’UTR，降低RMND5A的mRNA水平和蛋白水平。同时，在HepG2、H460、H1299、H4100等肿瘤细胞中转染miR-138mimics后也能够显著下调RMND5A的mRNA表达水平，说明在多种肿瘤细胞中，miR-138都能够靶向RMND5A，并有可能参与各种肿瘤细胞的生物学过程。2.miR-138通过靶向RMND5A进而促进Exportin-5蛋白降解。RMND5A能够与RanBPM相结合，而RanBPM能够与Ran相结合，Ran属于Ras超家族成员之一的小GTP酶结合蛋白，对RNA和蛋白通过核孔复合物至关重要。因此， RMND5A可能参与前体miRNA出核的重要过程，我们通过免疫共沉淀的方法鉴定出RMND5A与Exportin-5在体外能够相互结合，而Exportin-5为介导前体miRNA出核的关键分子。敲低HeLa细胞内的RMND5A之后，Exportin-5蛋白表达也受到抑制，而mRNA水平并未受影响，说明RMND5A并不影响Exportin-5的转录水平。同时，发现转染siRMND5A的HeLa细胞在放线菌酮作用下，Exportin-5的半衰期明显变短，进而推测RMND5A可能通过与Exportin-5的相互结合作用而阻止其蛋白降解。3.miR-138通过靶向RMND5A进而抑制前体miRNA出核并降低整体miRNA水平。由第二部分的实验结果，我们推测RMND5A与Exportin-5的相互作用会对细胞核和细胞质中的前体miRNA分布以及对细胞中整体miRNA水平有影响，我们通过在HeLa细胞中转染miR-138mimics或RMND5A siRNA，分别随机检测细胞核和细胞质中的前体miRNA（包括pre-miR-105/19a/7-1/7-2/7-3/128-1/93/30a/17/107/138-1/23a/128-2/124-3/142）水平以及细胞中相应miRNA的整体水平，发现在转染miR-138mimics和RMND5A siRNA的情况下，前体miRNA的核质分布比例大于对照组，并且细胞中相对应的miRNA水平下降。同时，miRNA芯片结果显示转染了miR-138mimics后的HeLa细胞中至少有75种miRNA下调，进一步验证了miR-138作用于miRNA的普遍性。这说明，miR-138能够靶向RMND5A进而阻滞前体miRNA出核并导致部分miRNA水平下降。同时，我们发现被下调的miRNA中大部分miRNA与细胞迁移能力相关，它们的潜在靶基因具有抑制或促进细胞迁移的能力。4.miR-138通过靶向RMND5A抑制HeLa细胞迁移。在HeLa细胞中转染miR-138mimics和RMND5A siRNA均可以抑制HeLa细胞划痕修复能力和迁移能力。结果提示，miR-138能够作为一个抑癌miRNA，抑制宫颈癌HeLa细胞的迁移。综上所述，我们首次预测并鉴定了miR-138在HeLa细胞中可以靶向RMND5A，发现了RMND5A通过与Exportin-5的相互作用抑制后者蛋白降解的新功能。过表达miR-138可以降低RMND5A水平，促进Exportin-5蛋白降解，从而抑制前体miRNA的出核并降低miRNA整体水平，进而表现为对HeLa细胞迁移能力的抑制。在mRNA的3’末端通常含有多聚腺苷酸，其在调控mRNA的稳定性、转录效率及出核中发挥重要作用。我们发现在MCF-7细胞中，依赖于H1启动子体内转录的多聚腺苷酸能够加速外源绿色荧光蛋白(GFP)mRNA从细胞核向细胞质输出。利用此方法，我们对外源p53基因的表达也观察到了类似的结果。我们的研究结果表明，通过体内转录多聚腺苷酸从而加速外源基因在细胞内的表达策略，可能对基因疗法或快速研究某个特异基因的功能具有重要的意义。