【摘 要】
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科学合理使用化学药物有利于提高农畜产品的产量和质量、保障人类健康,在食品安全中发挥着关键作用;化学药物的不当使用导致食品中农兽药残留超标,对生态环境和国民健康造成危害。本研究以高关注的六种化学药物为研究对象,包括四种农药（双酰胺、扑草净、抑霉唑、嘧霉胺）以及两种兽药（氨苯砜、莨菪碱）,制备了准确识别六种化合物的特异性高灵敏单克隆抗体,并建立了酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法,应用于食品中六种化学药
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科学合理使用化学药物有利于提高农畜产品的产量和质量、保障人类健康,在食品安全中发挥着关键作用;化学药物的不当使用导致食品中农兽药残留超标,对生态环境和国民健康造成危害。本研究以高关注的六种化学药物为研究对象,包括四种农药（双酰胺、扑草净、抑霉唑、嘧霉胺）以及两种兽药（氨苯砜、莨菪碱）,制备了准确识别六种化合物的特异性高灵敏单克隆抗体,并建立了酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法,应用于食品中六种化学药物残留测定。基于研究对象的化学结构特点设计、衍生半抗原。以环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺的母核结构为基础,以苯甲酰胺基为间隔臂位点延长引入活性基团羧基制备双酰胺半抗原;扑草净甲硫基延长引入羧基制备扑草净半抗原;咪唑乙醇羟基与卤代酯发生取代后通过酯水解引入羧基制备抑霉唑半抗原;嘧霉胺苯环处引入羧基作为半抗原;氨苯砜含有活性基团氨基,直接以原药作为半抗原;莨菪碱通过与丁二酸酐发生亲核取代引入羧基作为半抗原。通过半抗原活性基团与载体蛋白偶联制备完全抗原,充分暴露特定抗原表位。应用制备的六种药物的完全抗原,分别开展动物免疫与筛选、杂交瘤制备与纯化等实验,得到了六株杂交瘤细胞株,并进一步制备出六种单克隆抗体,分别为:双酰胺4F5、扑草净1A2、抑霉唑3G5、嘧霉胺4A11、氨苯砜2H9、莨菪碱2F6。六种抗体分别属于Ig G1、Ig G2a、Ig G2a、Ig G1、Ig G2b、Ig G2a亚型;亲和力常数分别为3.87×10~9 L/mo L、3.47×10~9 L/mo L、1.66×10~9L/mo L、7.03×10~9 L/mo L、3.55×10~9 L/mo L、2.45×10~9 L/mo L,均属于高亲和力抗体。分别优化检测液的p H值、离子强度（Na Cl含量）、有机溶剂（甲醇含量）,基于上述六种抗体建立了检测双酰胺、扑草净、抑霉唑、嘧霉胺、氨苯砜及莨菪碱的酶联免疫吸附测定法（ELISA）。双酰胺4F5为群选型抗体,可特异性识别四种双酰胺药物:对环溴虫酰胺的半数抑制浓度(IC50)为0.16 ng/m L,线性范围0.04～0.57 ng/m L;对溴氰虫酰胺IC50为0.09 ng/m L,线性范围0.02～0.54 ng/m L;对氯虫苯甲酰胺IC50为0.06ng/m L,线性范围0.01～0.28 ng/m L;对四氯虫酰胺IC50为0.19 ng/m L,线性范围0.06～0.68 ng/m L。扑草净1A2、抑霉唑3G5、嘧霉胺4A11、氨苯砜2H9、莨菪碱2F6均为单一特异性抗体,对其他结构类似物交叉较小或无交叉。应用建立的方法检测相应药物,对扑草净IC50为0.65 ng/m L,线性范围0.17～2.41 ng/m L;对抑霉唑IC50为0.95ng/m L,线性范围0.27～3.36 ng/m L;对嘧霉胺IC50为0.81 ng/m L,线性范围0.17～3.78ng/m L;对氨苯砜IC50为0.59 ng/m L,线性范围0.18～1.90 ng/m L;对莨菪碱IC50为0.92ng/m L,线性范围0.22～3.92 ng/m L。在果蔬样本中对四种农药进行添加回收实验,得到双酰胺类农药的回收率为83.2%～107.7%,扑草净回收率为85.7%～108.4%,抑霉唑回收率为85.3%～106.7%,嘧霉胺回收率为84.0%～105.9%;在牛奶样本中对两种兽药进行添加回收实验,得到氨苯砜的回收率为89.0%～106.2%,莨菪碱回收率为85.5%～93.8%;可满足实际样本的测定要求。通过柠檬酸三钠还原法制备了粒径18 nm的胶体金,并分别标记六种单克隆抗体;进一步通过优化标金抗体浓度、喷膜抗原浓度等分别制备了免疫层析试纸条,建立了检测双酰胺、扑草净、抑霉唑、嘧霉胺、氨苯砜及莨菪碱的免疫层析快速检测法。用免疫层析试纸条检测果蔬样本中的双酰胺,对环溴虫酰胺、溴氰虫酰胺、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺的消线值分别为10 ng/g、5 ng/g、2.5 ng/g、10 ng/g;在果蔬样本中分别检测扑草净、抑霉唑、嘧霉胺,试纸条的消线值均为10 ng/g;在牛奶样本中检测氨苯砜、莨菪碱,试纸条的消线值均为20 ng/m L;能够满足检测要求。所建立的免疫层析试纸条可用于食品中对双酰胺、扑草净、抑霉唑、嘧霉胺、氨苯砜、莨菪碱药物残留的高通量、快速筛查。
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