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东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是一种由镰形扇头蜱经卵传播的血液原虫,只引起水牛巴贝斯虫病。本实验室前期的研究证实东方巴贝斯虫是一独立新种。因为东方巴贝斯虫只感染水牛,不感染黄牛和奶牛,推测可能与不同巴贝斯虫入侵配体或不同种牛红细胞受体的不同有关。由于东方巴贝斯虫裂殖子入侵红细胞的分子过程还不清楚,为从分子水平上寻找东方巴贝斯虫仅感染水牛而不感染黄牛和奶牛的原因,本研究主要从东方巴贝斯虫入侵相关的牛红细胞受体与东方巴贝斯虫入侵相关配体两方面进行研究。1.牛红细胞表面受体糖蛋白基因的克隆,分析与表达。(1)黄牛、奶牛和水牛红细胞表面受体GYPC、DARC和GYPA基因的克隆及序列分析根据GenBank公布的牛Glycophorins C (GYPC)、Duffy antigen/chemokine receptor (DARC)、Glycophorins A (GYPA)基因序列分别设计四对、两对、六对特异性引物,采用PCR方法分别从黄牛、奶牛和水牛全血基因组中扩增得到GYPC、 DAR、GYPA的基因片段,分别构建克隆载体后测序鉴定。利用clustalx和Primer Premier5.0拼接GYPC四个外显子序列、DARC的两个外显子序列和GYPA的六个外显子序列。利用DNAStar软件预测黄牛、奶牛和水牛的GYPC、DARC和GYPA的亲水性、抗原性、表面活性、等电点、一级结构、二级结构等,利用在线软件预测跨膜区,糖基化位点和信号肽,并进行比较分析。结果表明水牛GYPC、GYPA的一级结构,二级结构,等电点,糖基化位点与数目与黄牛和奶牛的GYPC都有较大差异；黄牛、奶牛和水牛DARC的等电点,一级结构,二级结构,等电点,跨膜区,糖基化位点都有差异。(2)黄牛GYPA基因的真核表达将人工合成的黄牛GYPA基因插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,并连接绿色荧光蛋白基因EGFP, pCDNA3.1(+)-GYPA-EGFP质粒测序鉴定后,通过脂质体转染PK, MDBK细胞,24h时可以看到绿色荧光,36h时荧光最强。空白荧光对照质粒pCDNA3.1(+)-EGFP的荧光分布于细胞内,pCDNA3.1(+)-GYPA-EGFP质粒转染细胞后荧光分布在细胞膜周围且荧光强度弱于空白荧光对照质粒pCDNA3.1(+)-EGFP,这是由于GYPA基因含有信号肽,蛋白质表达后分泌到细胞表面,而且目的蛋白的表达降低了荧光蛋白的强度。总之,通过黄牛、奶牛和水牛GYPC、DARC和GYPA的克隆和序列比较分析,推测水牛GYPC、GYPA序列与黄牛、奶牛的差异较大,可能是东方巴贝斯虫只感染水牛的原因,具有深入研究价值。2.东方巴贝斯虫SBP3基因的克隆,序列分析,原核表达及免疫反应性研究(1)东方巴贝斯虫SBP3基因的克隆及序列分析利用本实验室东方巴贝斯虫基因组测序结果和GenBank中相关的牛巴贝斯虫SBP3基因序列,设计特异引物,以含虫全血基因组作为模板,通过PCR扩增获得东方巴贝斯虫的SBP3基因,测序结果显示序列全长为3237bp,为一个完整的开放阅读框,推测出蛋白质分子量为118kDa,含1079个氨基酸残基。基因序列同源性分析分析结果表明东方巴贝斯虫与牛巴贝斯虫SBP3(GenBank序列号：AF107117.1)序列同源性最高为70%,东方巴贝斯虫SBP3比牛巴贝斯虫基因序列少33bp,蛋白质序列少11AA,进一步说明东方巴贝斯虫是新种。利用DNAStar软件中的Protean预测东方巴贝斯虫SBP3抗原决定簇,结果表明其具有良好的抗原性。(2)东方巴贝斯虫SBP3的原核表达及免疫反应性研究SBP3基因截短表达,分三段命名为SBP3-1,SBP3-2,SBP3-3,长度分别为927bp,1329bp,1026bp。克隆入pET-28a(+)原核表达载体中,构建pET-28a(+)-SBP3-1,pET-28a(+)-SBP3-2,pET-28a(+)-SBP3-3原核表达质粒。将构建的质粒转化至大肠杆菌BL21-CondonPlus, IPTG诱导HIS-SBP3融合蛋白表达。Western-blot检测获得40kD,53kD,42kD的目的带,大小与蛋白理论预测值相符,表明SBP3重组蛋白与东方巴贝斯虫病阳性牛血清的天然抗体发生特异性反应,说明东方巴贝斯虫SBP3具有很好的免疫反应原性。本研究完成了东方巴贝斯虫SBP3的克隆,原核表达,Western-blot,表明SBP3可作为潜在的免疫检测和亚单位疫苗的候选抗原。