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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。目前临床上广泛应用疫苗来对PEDV进行防控,但是预防效果并不佳,PED还是会时常发生,并给养猪业带来了巨大的经济损失,而单克隆抗体在疾病的诊断、治疗方面,具有特异性强、灵敏度高等优势,因此本试验应用常规的淋巴细胞杂交瘤技术,制备抗PEDV的单克隆抗体IgA,旨在研究特异性的IgA抗体对病毒增殖的影响,将为PED治疗药物的开发提供物质基础和理论依据。 本研究将PEDV细胞毒经超速离心进行纯化,结果显示,纯化PEDV的浓度为4.802mg/ml。以纯化的PEDV作为包被抗原,通过一系列条件的优化,建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法。优化结果显示,最佳包被抗原浓度为6.0μg/mL;阴阳性血清最佳稀释度为1∶80,37℃作用1h;封闭液为含5%新生牛血清的PBST工作液;酶标抗体最佳稀释度为1∶2000,37℃作用45min;TMB显色时间为15min;抗体临界值为OD450nm≥0.267判定为阳性,OD450nm<0.267判定为阴性。特异性试验显示,该方法与TGEV、RV、CSFV、PRRSV、PrV和PCV2阳性血清不发生交叉反应;重复性试验显示,批内和批间重复性试验的变异系数均值都小于10%。因此,该方法具有较好的特异性和重复性,为阳性杂交瘤细胞的筛选奠定了基础。 将纯化的PEDV作为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELISA方法,制备并筛选了7株稳定分泌抗PEDV McAb的杂交瘤细胞,分别命名为3B5、5D10、5C3、1F8、2C7、4E3和2E7。经过单克隆抗体亚型的鉴定,5C3、4E3和2E7的抗体亚型均为IgMk;3B5、1F8抗体亚型均为IgG1k;5D10和2C7抗体亚型分别为IgG2ak和IgAk。秋水仙素法分析染色体数量,结果显示,7株杂交瘤细胞的染色体数量在95~103之间。IFA鉴定结果显示,7株McAb均能够与Vero细胞上增殖的PEDV特异性结合。ELISA检测结果显示,7株杂交瘤细胞的培养上清抗体效价分别为1∶320、1∶160、1∶160、1∶160、1∶80、1∶640、1∶320,相应的腹水效价分别为1∶104、1∶104、1∶103、1∶104、1∶102、1∶106、1∶105。将7株杂交瘤细胞连续传代30代,均能稳定的分泌抗体。 鉴于本试验研究单克隆抗体IgA抗PEDV活性的影响,因此应用IgA类单克隆抗体纯化试剂盒对2C7株杂交瘤细胞制备的相应腹水进行纯化,纯化结果显示:IgA抗体浓度为3.063mg/ml。体外抗病毒研究采用细胞中性红染色法病毒中和实验,结果经SPSS软件分析显示,实验组与对照组的OD450nm值存在显著性差异(P<0.05),而且抗体的浓度越高差异越明显。体内抗病毒研究采用初生仔猪的预防性实验,通过口服不同剂量的IgA单克隆抗体,24h后给仔猪灌服PEDV细胞毒,应用荧光定量RT-PCR检测仔猪肠内容物中的病毒,结果显示,虽然不同剂量的实验组之间没有明显的差异,但是与病毒对照组相比,实验组中PEDV的阳性检出率明显下降。综上所述,本试验制备的抗PEDV的单克隆抗体IgA,在体外、体内均具有中和病毒的作用,因此,为今后研制PEDV的新型治疗药物提供了新的思路。