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背景肽酰基精氨酸脱亚胺酶--PADI4（Peptidylarginine deiminase4），广泛分布于动物组织中，其编码的酶可以催化精氨酸残基转化为瓜氨酸残基，此过程称为瓜氨酸化。PADI4在造血细胞中很少表达，但是在经ATRA和PMA诱导HL60细胞向粒细胞以及巨噬细胞分化过程中可以检测到PADI4的表达， PADI4包含2238个碱基对，编码663个氨基酸，分子量为67KDa，随着白血病细胞粒系分化，在转录水平和翻译水平都可以检测到PADI4的增高，因此考虑PADI4和白血病细胞的分化与凋亡有关。但是在生理状态下，PADI4的功能及其其作用的机制还不是很明确。Sox家族分子为一类基因转录调控基因，其蛋白以HMG-box与DNA结合，参与性别决定、神经嵴细胞的发育、中枢神经系统、软骨形成、晶状体发育、心脏发育和造血等多种重要的生物学过程。Sox4是Sox(SRY-related HMG-box)转录因子家族重要成员，编码474个氨基酸，分子量为47KDa，在发育发展中起重要作用，可作为转录因子协同PU.1，CREB，PML/RARα以及增强PI3K/AKT和MAPK信号通路等多种机制抑制白血病细胞分化，诱导白血病发生。在急性白血病细胞中，sox4是PI3K/AKT和MAPK途径的重要激活剂。白血病属于血液系统的恶性克隆性疾病，目前大部分仍无法彻底治愈。文献报道，PADI4在多种恶性肿瘤中高表达且参与其发生发展，在良性肿瘤中低表达或不表达，表明PADI4在恶性肿瘤中发挥相应的作用。然而，PADI4在白血病细胞HL-60中不表达，随着细胞向粒系分化，PADI4的表达逐渐增高，而sox4通过多种途径抑制白血病细胞的分化，猜想PADI4和sox4之间有一定的关联性，为此进行研究，希望可以成为治疗白血病的新靶点。在前人研究的基础上，我们设计了相关实验，探讨PADI4和sox4与白血病细胞分化的关系，为其临床治疗提供新的理论依据和治疗靶点。目的通过体外实验探讨PADI4基因靶向sox4基因与白血病细胞分化是否有关为切入点，重点观察HL60细胞经全反式维甲酸诱导向粒系分化后PADI4和sox4表达变化，以及两者是否存在相互作用，并进一步阐明PADI4靶向调控sox4的机制。方法建立全反式维甲酸诱导HL60细胞模型，于诱导的0h和96h后，流式检测CD11b的表达，以及吉姆撒染色观察细胞形态验证模型建立是否成功。于诱导的0h、24h、48h、72h和96h分别在转录和翻译水平检测PADI4表达变化，干扰PADI4后流式检测CD11b的表达，检验PADI4是否影响细胞分化。提取ATRA诱导HL-60后的浆蛋白和核蛋白，检测PADI4的变化趋势，免疫细胞化学检测PADI4的定位。于诱导的0h、24h、48h、72h和96h分别在转录和翻译水平检测sox4表达变化，体外细胞实验，采用RNAi技术，合成干扰PADI4的siRNA转染至HL60细胞，调控PADI4在HL60细胞中的表达，RT-PCR观察对sox4基因表达的影响；构建sox4启动子的双荧光素酶报告载体，转染HEC293T细胞，检测PADI4与其结合部位，通过ChIP检测其具体结合域；构建sox4的四个结构域，通过Co-IP检测PADI4与sox4蛋白间的相互作用。每组实验都要必须重复至少3次，实验数据结果采用均数±标准差表示，均数采用t检验分析，以P<0.05为有统计学意义。结果全反式维甲酸诱导HL60细胞后，在诱导的96h内，PADI4在转录和翻译水平呈现出一致的升高趋势，干扰PADI4后，流式检测到细胞表面的CD11b降低，即PADI4影响白血病细胞的分化。Western Blot检测到PADI4由胞浆转移到胞核发挥作用。免疫细胞化学结果说明PADI4在细胞核内发挥作用。在转录和翻译水平检测sox4，结果呈现和PADI4相反的降低趋势，且设计siRNA干扰PADI4后，RT-PCR结果sox4的表达升高，说明PADI4调控sox4的表达。构建sox4启动子荧光素酶报告基因载体后，做报告基因实验检测PADI4可以结合sox4的启动子，通过ChIP实验证明PADI4可以结合sox4启动子-220-0区域。Co-IP实验证明PADI4和sox4蛋白间存在相互作用。结论PADI4基因与白血病细胞的分化有关。随着HL60细胞分化程度的提高，PADI4在转录和翻译水平均逐渐升高，干扰PADI4后，抑制细胞的分化。PADI4可转移到细胞核内，作为转录因子，调控基因的转录。sox4在转录和翻译水平均逐渐降低，干扰PADI4后，sox4的表达升高，说明PADI4可以调控sox4的表达。PADI4可结合sox4的启动子-220-0区域且两者之间存在蛋白间的相互作用。