狭叶松果菊(Echinacea．angustifolia D C)是菊科(Composime)松果菊属(Echinacea)植物，原产美洲，是北美印第安人的传统草药。其主要活性成分为咖啡酸衍生物、烷基酰胺类物质及多糖类物质。狭叶松果菊提取物具有增强机体免疫功能、抗各种感染、抗氧化、抗肿瘤等作用，其疗效得到了越来越多的临床肯定，成为国际市场需求量最大的植物药之一。 狭叶松果菊中咖啡酸衍生物主要包括松果菊苷(Echmacoside)、菊苣酸(Cichoric acid)、洋蓟酸(Cynarin)、咖啡酸(Caffeic acid)以及绿原酸(Chlorogenic Acid)等，但含量极低。从上世纪70年代开始，人们开始尝试采用不同的方法提高目标次生代谢产物的含量，其中开展生物合成代谢研究是提高次生代谢物中有效成分的方法之一。研究表明，咖啡酸衍生物的生物合成是典型的苯丙烷代谢途径，尤其是绿原酸的生物合成途径已基本阐明。但在狭叶松果菊中甚至松果菊属植物中咖啡酸衍生物的生物合成途径研究甚少，尤其是对此代谢途径上的关键酶、限速酶基因的克隆、功能验证等尚未见报道。 本文以狭叶松果菊组培苗为材料，采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNAends RACE)技术，首次从狭叶松果菊组培苗中分离克隆出苯丙烷代谢途径上的第二个关键酶基因肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate4—hydorxylase C4H)基因(EaC4H1)的全长cDNA及其同源基因(EaC4H2)的全长cDNA，并对其进行了相关研究。另外，首次通过培养基中添加前体物对狭叶松果菊组培苗中绿原酸积累进行了研究。本文的主要研究内容及结果如下： 1．EaC4H1基因：利用RACE技术得到一个全长为1672bp的EaC4H1基因的cDNA序列(Genbank登陆号：EU676019)。根据生物信息学分析该基因cDNA含有一个1518 bp的开放阅读框(ORE)，编码一个由505个氨基酸残基组成的蛋白质；预测的分子量约为57.84kDa，等电点(pI)为9.15。对该基因的氨基酸水平进行同源比对表明，EaC4H1蛋白与其它物种的C4H蛋白具有较高的同源性，并且具有细胞色素P450蛋白家族的保守区域。同时，成功构建了pET32a—C4H1原核表达载体，为进一步研究EaC4H1蛋白的原核表达、纯化及功能研究奠定了基础。 2．EaC4H2基因：在克隆EaC4H1基因的过程中，得到了其家族同源基因EaC4H2(Genbank登陆号：EU853304)。该基因的cDNA序列全长为1676bp。根据生物信息学分析该基因cDNA含有一个1518 bp的开放阅读框(ORF)，编码一个由505个氨基酸残基组成的蛋白质；预测的分子量约为57.78kDa，等电点(pI)为9.16。对该基因的氨基酸水平进行同源比对表明，EaC4H2蛋白与其它物种的CAH蛋白具有较高的同源性，并且具有细胞色素P450蛋白家族的保守区域。 3．前体添加物对狭叶松果菊中绿原酸积累的研究：通过向狭叶松果菊组培苗的培养基中添加不同浓度的苯丙氨酸(0、5、10、20、30mg/L)和酪氨酸(0、5、10、20、30mg/L)，培养30天后，用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定不同处理下整株组培苗中绿原酸的含量表明，苯丙氨酸和酪氨酸的添加都对狭叶松果菊中绿原酸的积累有影响：苯丙氨酸在添加浓度为30mg/L时，绿原酸的积累量最高，达到973.87mg/mL，而酪氨酸在添加浓度为5mg/L时，绿原酸的积累量最高，达到887.50mg/mL。