[目的]通过Ames试验、彗星试验、小鼠骨髓微核试验、小鼠精子畸形试验,从基因水平、DNA水平及染色体水平对不同粒径纳米氧化铝致遗传毒性进行综合评价,并初步探讨其作用机制。[方法]1、细菌回复突变(Ames)试验(1)实验前对纳米氧化铝(13nm和50nm)颗粒进行表征用Image-pro plus图像分析软件进行粒径分析,nano-ZS90纳米粒度仪进行电位分析。(2)Ames试验通过加和不加肝S9混合物条件下,采用组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌(TA97.TA98.TA100.TA102菌株)进行细菌的回复突变(Ames)实验。选用纳米氧化铝(13nm和50nm)及微米氧化铝(10μm)三个粒径组,设空白对照组、溶剂(DMSO)对照组、0.0005mg/皿、0.005mg/皿、0.05、mg/皿、0.5mg/皿、5mg/皿、阳性对照组。(3)细菌氧化应激指标选用谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒评估细菌的氧化应激反应。2、彗星试验(1)IC50的测定,调整细胞数为2×104个/ml,均匀接种到六孔板中,细胞贴壁后,弃原培养液,分别加入含不同浓度的纳米氧化铝(13nm和50nm)及微米氧化铝(10μm)的新培养液,其终浓度为0、1.5、3.0、6.2、12.5、25、50、100μgeml,共八个剂量组。每个浓度设3个平行样。作用24h后,去除各孔中的培养液,用D-Hank s液洗2遍,用0.25%胰酶消化细胞后,制成单细胞悬液。倒置显微镜下计数各孔的存活细胞数,取均值,计算抑制率,重复3次。并用概率单位法求出各尺寸氧化铝的半数抑制浓度IC50。(2)荧光标记纳米颗粒进入细胞情况观察取cy5.5荧光标记的纳米氧化铝颗粒(13nm)、纳米氧化铝颗粒(50nm)、微米氧化铝颗粒(10μm)染毒细胞,染毒终浓度为30μg/ml,染毒3h时用Hoechst荧光染液加入细胞培养液中,终浓度为5μg/ml,15分钟后用D-Hank’s液清洗2次,在荧光显微镜下观察不同粒径纳米氧化铝颗粒进入细胞情况并拍照。(3)单细胞琼脂糖凝胶电泳(SCGE)试验选用纳米氧化铝颗粒(13nm和50nm)、微米氧化铝颗粒(10μm)三个粒径组,设空白对照组、低剂量(15μg/ml).中剂量(30μg/ml).高剂量(60pμg/ml)和阳性对照组(丝裂霉素C0.5μg/ml),染毒12、24、48h后处理细胞。用单细胞琼脂糖凝胶电泳(SCGE)检测DNA损伤,以Olive尾距值评价DNA损伤程度；(4)细胞的氧化应激指标选用谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒评估细胞的氧化应激反应。3、小鼠骨髓微核试验将55只雄性和55只雌性ICR小鼠随机分为11组,每组5只,选用纳米氧化铝颗粒(13nm和50nm)、微米氧化铝颗粒(10μm)三个粒径组,设空白对照组、低剂量(300mg/kg)、中剂量(600mg/kg)、高剂量(1200mg/kg)和阳性对照组(环磷酰胺40mg/kg),用腹腔注射方式染毒。留取骨髓涂片,计数微核率。4、小鼠精子畸形试验(1)小鼠精子畸形实验55只雄性ICR小鼠随机分为11组,每组5只,选用纳米氧化铝颗粒(13nm)、纳米氧化铝颗粒(50nm)、微米氧化铝颗粒(10μm)三个粒径组,设空白对照组、低剂量(300mg/kg)、中剂量(600mg/kg)、高剂量(1200mg/kg)和阳性对照组(环磷酰胺40mg/kg),用腹腔注射对动物连续五天进行染毒。第35天脱臼处死会取附睾及睾丸,计数精子畸形率。(2)睾丸病理形态学将一侧睾丸置于4%中性福尔马林溶液中固定24h后,常规脱水、透明,石蜡包埋、切片(切片厚约4mm)。再依次HE染色、封片、镜检并摄片。(3)小鼠睾丸氧化应激反应指标选用谷胱甘肽氧化酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒评估睾丸的氧化应激反应。[结果]1、细菌回复突变(Ames)试验(1)纳米氧化铝颗粒表征纳米氧化铝13nm、50nm的平均粒径分别为20.9±9.5nm、112.4±9.1nm, Zeta电位分别为49.4±2.2mV、44.3±9.1mV.(2) Ames试验纳米氧化铝及微米氧化铝回复突变试验非活化平板掺入试验中,阳性对照组菌株的回变菌落数增加,并超过空白对照组的2倍以上,且差别有统计学意义(P<0.01),溶剂对照组与小于空白对照组细菌回变数的2倍。纳米氧化铝(13nm、50nm)及微米氧化铝(10gm)剂量组中各菌株细菌回变菌落数小于空白对照组细菌回变数的2倍。纳米氧化铝及微米氧化铝回复突变试验活化平板掺入试验中,阳性对照组菌株的回变菌落数明显增加,特别是菌株TA97、TA98、TA100,并超过空白对照组的2倍以上,且差别有统计学意义(P<0.01),溶剂对照组与空白对照组细菌回变数的2倍。纳米氧化铝(13nm、50nm)和微米氧化铝(10μm)剂量组中各菌株细菌回变菌落数小于空白对照组细菌回数的2倍。(3)细菌的氧化应激反应指标测定在加肝S9混合物情况下,纳米氧化铝(13nm、50nm)和微米氧化铝(10μm)剂量组中各菌株的GSH、SOD、MDA、T-AOC测定值,与空白对照组差异没有统计学意义(P>0.05)。2、彗星试验(1)IC50测定根据概率单位法计算出纳米氧化铝(13nm) IC50为56.75μg/ml、纳米氧化铝(50nm) IC50为44.06μg/ml、微米氧化铝(10μm)ICso为64.27μg/ml。为了便于各粒径组之间比较,统一染毒剂量,高剂量为60μg/ml、中剂量为30μg/ml、低剂量为15μg/ml、(2)荧光Hoechst染色可见CHL细胞的细胞核呈现均匀蓝染的荧光。Cy5.5荧光标记氧化铝颗粒为红色颗粒。融合图为Hoechst染色图和荧光标记氧化铝图组合,纳米氧化铝颗粒染毒组可见较多的荧光标记的纳米颗粒进入胞质,微米氧化铝颗粒组较少。(3)单细胞琼脂糖凝胶电泳(SCGE)结果空白对照组彗星头部DNA致密,无明显尾部或尾部很短。各染毒组头部DNA集中,亮度较强,尾部由DNA断片组成呈扫帚状,荧光强度不及头部。剂量效应：在染毒12、24、48h,随着染毒剂量增加,与空白对照组相比,不同粒径组的低、中、高剂量组Olive尾矩有增加趋势,高剂量组增加明显,与中、高剂量组差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。时间效应：,纳米氧化铝(13nm)组、纳米氧化铝(50nm)组和微米氧化铝(10μm)组Olive尾矩,随着染毒时间延长,有增加趋势,48h时各粒径组Olive尾矩与12、24h之间差异有统计学意义(P<0.05),24h与12h之间差异有统计学意义(P<0.05)。粒径效应：48h时,纳米氧化铝(50nm)组Olive尾矩与纳米氧化铝(13nm)组和微米氧化铝(10μm)组之间差异有统计学意义(P<0.05)。(4)细胞氧化应激反应水平测定谷胱甘肽(GSH)测定结果,剂量效应：在染毒24、48h时,随着染毒剂量增加,与空白对照组相比,不同粒径组的低、中、高剂量组GSH有减少趋势,中、高剂量组GSH与空白对照组差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。时间效应：,纳米氧化铝(50nm)组GSH,随着染毒时间延长,有减少趋势,48h与12、24h之间差异有统计学意义(P<0.05),12h与24h之间差异没有统计学意义(P>0.05)。粒径效应：48h时,纳米氧化铝(50nm)组GSH与纳米氧化铝(13nm)组和微米氧化铝(10μm)组之间差异有统计学意义(P<0.05)。超氧化物歧化酶(SOD)测定结果,剂量效应：,在染毒12、24h时,随着染毒剂量增加,纳米氧化铝(13nm)组及微米氧化铝(10μm)的低、中、高剂量组SOD与空白对照组相比,有减少趋势,高剂量组SOD与空白对照组差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。纳米氧化铝(50nm)组的低、中剂量组SOD与空白对照组有升高趋势。在染毒48h时,随着染毒剂量增加,不同粒径组的低、中、高剂量组SOD与空白对照组相比,有减少趋势,纳米氧化铝(13nm)组、纳米氧化铝(50nm)组及微米氧化铝(10μm)中、高剂量组SOD与空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。时间效应：,纳米氧化铝(13nm)组、纳米氧化铝(50nm)组及微米氧化铝(10μm)组SOD,随着染毒时间延长,有减少趋势,48h与12h之间差异有统计学意义(P<0.01)。粒径效应：48h时,纳米氧化铝(50nm)组SOD与纳米氧化铝(13nm)组和微米氧化铝(10μm)组之间差异有统计学意义(P<0.05)。纳米氧化铝(13nm)组与微米氧化铝(10μm)组之间差异有统计学意义(P<0.05)。丙二醛(MDA)测定结果,剂量效应：,在染毒12、24、48h时,随着染毒剂量增加,各粒径组的低、中、高剂量组MDA与空白对照组相比,有增加趋势,纳米氧化铝(13nm、50nm)组及微米氧化铝(10μm)组的中、高剂量组MDA与空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。时间效应：在纳米氧化铝(13nm)组随着染毒时间延长,有增加趋势,48h与12h、24h之间差异有统计学意义(P<0.05),24h与48h之间差异没有统计学意义(P>0.05)。纳米氧化铝(50nm)组与微米氧化铝(10μm)组MDA随着染毒时间延长,有增加趋势,48h与12h、24h之间差异有统计学意义(P<0.05),24h与48h之间差异有统计学意义(P<0.05)。粒径效应：24h时纳米氧化铝(50nm)组MDA与纳米氧化铝(13nm)组和微米氧化铝(10μm)之间差异有统计学意义(P<0.05)。48h时,纳米氧化铝(13nm)组和纳米氧化铝(50nm)组MDA与微米氧化铝(10μm)组之间差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),但纳米氧化铝(13nm)组和纳米氧化铝(50nm)组之间差异有差异没有统计学意义(P<0.05)。总抗氧化能力(T-AOC)测定结果,剂量效应：在染毒24、48h时,随着染毒剂量增加,不同粒径组的低、中、高剂量组T-AOC与空白对照组相比,有减少趋势,纳米氧化铝(13nm)组、纳米氧化铝(50nm)组及微米氧化铝(10μm)中、高剂量组T-AOC与空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。时间效应：不同粒径组的T-AOC,随着染毒时间延长,有减少趋势,纳米氧化铝(13nm)组、纳米氧化铝(50nm)组12h与48h之间差异有统计学意义(P<0.01)。粒径效应：48h时,纳米氧化铝(50nm)组T-AOC与纳米氧化铝(13rim)组和微米氧化铝(10μm)组之间差异有统计学意义(P<0.05)。3、小鼠骨髓微核试验在雌性组和雄性组中,与空白对照组相比,各粒径组不同剂量间的微核率均小于2‰。4、小鼠精子畸形试验(1)小鼠精子畸形率正常小鼠精子畸形率在0.8%-3.4%之间,各粒径组的空白对照组及低、中剂量组均在正常范围,高剂量组在正常范围之外,与空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。但各粒径组的高剂量组之间差异没有统计学意义(P>0.05)(2)小鼠睾丸病理变化空白对照组和低剂量组的各级生精细胞数量多,层次清晰。中剂量组管壁上的生精细胞较少,层次稍微减少,排列紊乱。高剂量组管壁上的生精细胞数量较少,层次减少,排列紊乱,形成不规则的空隙。(3)小鼠睾丸氧化应激谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测定结果,剂量效应：随着染毒剂量增加,纳米氧化铝(13nm)组、纳米氧化铝(50nm)组和微米氧化铝(10μm)组各剂量组的GSH-PX与空白对照组有减少趋势,高剂量组减少明显,不同粒径组的中、高剂量组与空白对照组差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。粒径效应：不同粒径组组间GSH-PX差异没有统计学意义(P>0.05)。超氧化物歧化酶(SOD)测定结果,剂量效应：随着染毒剂量增加,纳米氧化铝(13nm)组、纳米氧化铝(50nm)组和微米氧化铝(10μm)组各剂量组的SOD与空白对照组有减少趋势,高剂量组减少明显,纳米氧化铝(13nm)组和微米氧化铝(10μm)组的高剂量组与空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。纳米氧化铝(50nm)组中、高剂量组与空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。粒径效应：不同粒径组组间GSH-PX差异没有统计学意义(P>0.05)。丙二醛(MDA)测定结果,剂量效应;随着染毒剂量增加,纳米氧化铝(13nm)组、纳米氧化铝(50nm)组和微米氧化铝(10μm)组各剂量组的MDA与空白对照组有增加趋势,高剂量组增加明显,纳米氧化铝(13nm)组、纳米氧化铝(50nm)组和微米氧化铝(10μm)组的高剂量组与空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。粒径效应：微米氧化铝(10gm)组与纳米氧化铝(13nm)组和纳米氧化铝(50nm)组组间MDA差异有统计学意义(P<0.05)。总抗氧化能力(T-AOC)测定结果,剂量效应：随着染毒剂量增加,纳米氧化铝(13nm)组、纳米氧化铝(50nm)组和微米氧化铝(10μm)组各剂量组的T-AOC与空白对照组有减少趋势,高剂量组减少明显,不同粒径组的高剂量组与空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。粒径效应：不同粒径组组间T-AOC差异没有统计学意义(P>0.05)。[结论]1、纳米氧化铝(13nm和50nm)未见致突变性,未能引起细菌氧化应激反应。2、纳米氧化铝(13nm和50nm)可以进入细胞,并引起DNA损害,且存在时间、剂量及粒径效应关系,但与阳性对照组比,纳米氧化铝引起DNA损害程度很弱。能引起细胞氧化应激反应,推测氧化应激反应是DNA损害原因之一。3、纳米氧化铝(13nm和50nm)引起小鼠骨髓微核率在正常范围,小鼠骨髓微核试验阴性。4、纳米氧化铝(13nm和50nm)能引起小鼠睾丸结构损害,引起精子畸形率升高,但与阳性对照组比,纳米氧化铝引起小鼠精子畸形率很低。能引起睾丸组织氧化应激反应,有剂量、粒径效应关系。推测不同粒径纳米氧化铝引起小鼠精子畸形试验阳性及睾丸病理损伤与睾丸组织氧化应激有关。5、根据以上提示纳米氧化铝(13nm和50nm)可能引起遗传毒性,推测氧化应激反应参与这一过程。6、本课题局限和不足之处：(1)方法上的局限,尽管本课题选用标准的毒理学试验标准,但纳米颗粒作为新兴的化合物,是否需要新的或完善的针对性的试验方法可以进一步验证,(2)纳米氧化铝本身的小尺度效应、表面与界面等效应,其物理、化学性质还不清楚,(3)如何将该试验组合的试验结果外推至人体,合理反应纳米氧化铝在人体中的潜在危害还存在很大困难。