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本论文包括两部分:在第一部分建立了以质粒为基础的RNA干扰技术;在第二部分对凋亡相关基因HSD11基因的功能进行了研究。
本文首先以EGFP为靶基因建立了抑制外源基因表达的RNA干扰体系。将筛选的RNA干扰序列构建到含有U6启动子的psilencer-1.0-U6质粒中并将这些质粒与pEGFP-N1共转Hela细胞,荧光显微镜、流式细胞仪和Westernblot检测的结果证明构建的干扰质粒能够有效地抑制EGFP的表达,这表明构建的RNA干扰质粒能够抑制与之共转染的外源基因的表达。然后本文以HSD11基因为靶基因研究了干扰质粒对内源基因的抑制效果,筛选了六个干扰靶点并将它们分别构建至psilencer-2.1-U6-neo或psilencer-1.0-U6,免疫荧光、RT-PCR以及Westernblot结果表明六个干扰质粒都能够有效地抑制内源HSD11基因的表达。在上述研究中,比较了RNA干扰靶点的筛选、干扰质粒的选择等多种因素对RNA干扰效率的影响,还讨论了整个技术体系中应该注意的事项,其中特别讨论了筛选高效RNA干扰靶点的原则。
在文章的第二部分中对凋亡相关基因HSD11基因的功能进行了研究。HSD11基因是从人睾丸cDNA文库中克隆到的一个新基因,该基因定位于人15号染色体。HSD11基因cDNA全长1696bp,基因编码区长951bp,编码一个长度为316aa的蛋白质。本文首先采用RT-PCR和Westernblot研究了HSD11基因在正常组织和细胞系中的表达谱,结果表明HSD11基因广泛表达于各种组织和细胞系中。随后本文采用免疫组织化学、免疫荧光和Westernblot研究了HSD11基因在睾丸组织和Hela细胞中的组织和亚细胞定位,结果表明HSD11基因的产物表达于细胞核中。