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目的:探索藤黄酸(Gambogic acid,GA)抗转移性激素抵抗性前列腺癌(castrate resistant prostate cancer,CRPC)的活性及其作用机制。方法:为了探索和明确藤黄酸在转移性激素抵抗性前列腺癌中的作用及机制,我们以基因工程小鼠(PbCre4;Ptenfl/flTp53tfl/fl)的前列腺癌细胞(prostate cancer adenocarcinomaPten/Tp53null,PCAPs)和来源于不同遗传背景的转移性CRPC患者的异体种植肿瘤细胞(LuCaP)为主要模型,研究了藤黄酸在抗转移性CRPC中的作用及机制。1.不同中药单体对前列腺癌(Prostate cancer,PrCa)细胞的生长抑制作用。1.1基于活血解毒法筛选有效的抗前列腺药物。以11种不同的中药单体:隐丹参酮、丹参酮IIA,苦参碱、氧化苦参碱,莪术醇、姜黄素,盐酸小蘖碱,贝母素甲、贝母素乙,槲皮素和藤黄酸,按浓度梯度分别处理PCAP-1细胞,48h后用CTG检测活细胞比例。1.2藤黄酸对PCAPs细胞和PCAPs干/祖细胞的生长抑制实验。以不同浓度的藤黄酸分别处理2维培养的PCAPs细胞和3维培养的PCAP-1细胞的细胞球,24h或48h后用CTG检测PCAPs的活细胞比例;1周后行细胞成球试验(Sphere forming assay,SFA)和CTG-3D分别检测干/祖细胞的成球率和细胞球的活细胞数。1.3藤黄酸对人前列腺癌细胞系的生长抑制实验。以不同浓度的藤黄酸处理LNCaP、PC-3、DU145细胞,24h或48h后用CTG检测LNCaP、PC-3、DU145的活细胞比例。1.4藤黄酸对LuCaPs干/祖细胞的生长抑制实验。以不同浓度的藤黄酸分别处理来源于不同转移性CRPC且具有不同遗传异质性的LuCaPs,包括23.1、73、92、136、167细胞,2周后行SFA和CTG-3D分别检测干/祖细胞的成球率和细胞球的活细胞数。2.藤黄酸对PCAP-1细胞的凋亡诱导作用。2.1藤黄酸对PCAP-1的细胞周期调控作用。以500nM藤黄酸处理PCAP-1和B6WT细胞不同时间后,用PI染液将细胞染色,用流式细胞仪检测各周期细胞所占比例。2.2藤黄酸对PCAP-1细胞内CASP水平的调控作用。以500nM藤黄酸处理PCAP-1和B6WT细胞不同时间后,用WB检测细胞内CASP-3,8,9蛋白及对应活化物水平的变化。2.3 Z-VAD-FMK对藤黄酸作用的影响。以500nM藤黄酸单独或联合Z-VAD-FMK或DFOM处理PCAP-1细胞,24h后行CTG实验,检测Z-VAD-FMK或DFOM对藤黄酸抑制PCAP-1细胞生长作用的影响。3.活性氧类(ROS)在藤黄酸抑制前列腺癌细胞增殖、诱导凋亡中的作用。3.1藤黄酸对PCAP-1和LuCaPs细胞内ROS和线粒体膜电位(MMP)的影响。以500nM藤黄酸分别处理PCAP-1细胞、LuCaP92和LuCaP136的干/祖细胞,用CM-H2DCFDA将细胞染色后,用流式细胞分析检测细胞内ROS水平的变化;同时用JC-1和TMRM将细胞染色后,分别行Confocal和流式细胞分析检测细胞内MMP的变化。3.2 NAC联合藤黄酸对PCAP-1和LuCaPs细胞增殖抑制作用的影响。以不同浓度的藤黄酸单独或联合NAC分别处理PCAP-1细胞、LuCaP92和LuCaP136细胞,培养24h或2周后,用流式细胞分析检测NAC对PCAP-1细胞内ROS水平的影响,用CTG和CTG-3D分别检测NAC对藤黄酸抑制PCAP-1和LuCaPs的生长抑制作用的调节,用WB检测NAC对藤黄酸诱导的PCAP-1细胞内CASP活化的调节。4.藤黄酸对硫氧还蛋白(Trx)抗氧自由基系统的抑制作用。4.1筛选藤黄酸引起细胞内ROS聚集的机制。用不同浓度的藤黄酸单独或联合不同的 ROS 激活剂:包括 Rotenone,AntimycinA,BSO,Dioscin,AUR,处理 PCAP-1、LuCaP136细胞,24h后用CTG检测PCAPs的活细胞比例;2周后用CTG-3D检测LuCaP136的活细胞比例,筛选出对藤黄酸有协同作用的单体。4.2藤黄酸对Trx活性的抑制作用。用不同浓度的藤黄酸处理PCAP-1和LuCaP136细胞和相应的细胞提取物,用Trx活性检测试剂盒检测藤黄酸对Trx活性的影响,同时分别检测藤黄酸对Trx系统中其他两个重要成员:TrxR和NADPH活性的影响。5.藤黄酸对多西他赛、恩杂鲁胺抗转移性CRPC作用的影响。用不同浓度的藤黄酸与多西他赛、恩杂鲁胺联合处理LuCaP73、LuCaP92、LuCaP136,2周后用CTG-3D检测细胞活性,观察藤黄酸对多西他赛、恩杂鲁胺抗肿瘤作用的影响。结果:藤黄酸抗CRPC的作用及机制如下所述。1.藤黄酸显著抑制CRPC细胞及干/祖细胞的生长。1.1 以PCAP-1细胞为研究对象的增殖抑制实验结果提示藤黄酸是在测11中单体中抗细胞增殖作用最强的单体,抑制效率是隐丹参酮、姜黄素的50几倍。1.2 藤黄酸呈浓度、时间依赖性抑制PCAP-1以及其他三株来源于不同基因工程小鼠的PCAPs细胞的增殖,B6WT对藤黄酸的反应性明显弱于PCAPs;SFA和CTG-3D的结果提示藤黄酸呈浓度依赖性抑制PCAPs干/祖细胞的生长,200nM藤黄酸可完全抑制PCAP-1细胞成球。1.3 藤黄酸呈浓度、时间依赖性抑制LNCaP、PC-3、DU145细胞的生长,抑制作用略弱于PCAP-1细胞。1.4 藤黄酸呈浓度依赖性抑制LuCaPs细胞的的成球和生长,不同LuCaPs细胞对藤黄酸敏感性不同,但500nM藤黄酸可完全抑制在测LuCaPs细胞的成球。2.藤黄酸诱导PCAP-1细胞发生凋亡和铁凋亡。2.1 藤黄酸500nM作用4h可使PCAP-1细胞内subG1期细胞明显增多,但对B6WT细胞的subG1期无明显作用。2.2 藤黄酸500nM从6h开始诱导PCAP-1细胞内CASP-3,8,9活化,而对B6WT细胞内CASP的活化无明显作用。2.3 Z-VAD-FMK、DFOM单用和联合均可不同程度的抑制藤黄酸对PCAP-1细胞的生长抑制,其中以Z-VAD-FMK作用更为显著。3.藤黄酸引起的ROS聚集是其对列腺癌细胞生长抑制、凋亡诱导的原因。3.1 藤黄酸可显著引起PCAP-1细胞内ROS呈时间、浓度依赖性聚集,同时还可降低PCAP-1细胞的MMP,但对B6WT细胞内ROS无明显影响;藤黄酸也能呈时间依赖性降低LuCaP92和LuCaP136细胞的MMP。3.2 流式细胞分析检测提示NAC可完全中和藤黄酸导致的PCAP-1细胞内的ROS聚集。CTG实验发现NAC可完全逆转藤黄酸对PCAP-1细胞的生长抑制作用,即便是1μM的藤黄酸;WB实验发现NCA可完全逆转藤黄酸对PCAP-1细胞内CASP-3,8,9的活化。在LuCaPs中,NAC也能明显逆转藤黄酸对LuCaPs细胞的生长抑制,其中LuCaP92对NAC的作用最为敏感。4.藤黄酸显著抑制硫氧还蛋白的活性。4.1 AUR可以明显增强藤黄酸对PCAP-1和LuCaP136细胞的增殖抑制作用,而BSO对藤黄酸的作用无明显影响。4.2藤黄酸可明显抑制PCAP-1和LuCaP136细胞和细胞提取物内的Trx活性,而不抑制TrxR和NADPH的活性。5.藤黄酸在1μM浓度以下即可明显增强多西他赛、恩杂鲁胺对LuCaP73、92、136的生长抑制作用。结论:以不同来源的CRPC细胞为研究对象,我们均发现藤黄酸可通过抑制Trx的活性,破坏肿瘤细胞内ROS系统的平衡,导致细胞内ROS聚集,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡、铁凋亡;藤黄酸在CRPC的治疗中可增强多西他赛、恩杂鲁胺的作用;NAC在CRPC模型中对藤黄酸作用的部分逆转提示了藤黄酸可能存在基于不同遗传背景的其他作用机制。总的来说,藤黄酸诱导的ROS平衡失调对前列腺癌具有显著的抑制作用,同时可能存在其他抗CRPC作用机制,在抗CRPC的治疗中具有广泛地应用前景。