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a-淀粉酶(EC3.2.1.1a-amylase)能作用于淀粉分子的a-1,4糖苷键,随机地将淀粉从内部切成小分子的糊精和还原糖。α-淀粉酶是一类重要的工业用酶,广泛应用于水质改良、食品(饲料)工业、粮食加工、酿造、发酵以及医药等行业。本研究采用碘-碘化钾染色法鉴定淀粉酶产生菌,从实验室保存的海虾虾壳分离的菌种中筛选到一株高产α-淀粉酶的菌株DAU5。16S rDNA序列同源性分析和系统进化树结果表明,菌株DAU5属于微小杆菌属(Exiguobacterium),但不属于该属已知的任何种,故命名该菌株为Exiguobacterium sp. DAU5。为克隆Exiguobacterium sp. DAU5的a-淀粉酶基因,通过鸟枪法构建了Exiguobacterium sp. DAU5基因组DNA文库。从该文库筛选得到一株具有α-淀粉酶活性的克隆,对其插入的DNA片段序列分析得知AmyH基因的部分序列。根据此序列和GenBank收录的Exiguobacterium sp.AT1b全基因组序列中一段相似度极高的序列设计引物,PCR扩增得到了Exiguobacterium sp. DAU5AmyH基因。该基因开放阅读框全长1545bp,编码514个氨基酸,所表达的α-淀粉酶属于糖苷水解酶家族13,N末端含有一个长28aa的信号肽。以pET-32a(+)质粒作为载体,成功构建了AmyH基因的表达载体pET-AmyH-sp,并以E.coli BL21(trxB)为寄主菌对该基因诱导表达。表达的AmyH以包涵体形式出现,通过8M尿素变性,组氨酸标签亲和纯化,透析复性后成功得到了具有活性的AmyH纯化蛋白,其活性为每mg蛋白19.7x103U。SDS-PAGE显示AmyH融合蛋白大小约77kDa,使用肠激酶切除标签后的大小为57kDa,和氨基酸序列预测的大小一致。通过酶学性质研究得知：AmyH在30-40℃之间具有较好的活性,其中最适温度为40℃,40℃以下比较稳定,保持1h其酶活力基本不改变。AmyH在pH8.0时表现出较好的稳定性,其最适pH为8.5(甘氨酸-NaOH缓冲液)。Zn2+,Cu2+,Fe2+,SDS和EDTA对AmyH活性有极强抑制作用,5mM的浓度即可使AmyH完全失去活性；Li+, K+, Mg2+和Mn2+对AmyH有一定的抑制作用,而Ca2+,Ni2+和尿素对AmyH的活性无影响；AmyH对醇类和丙酮有较好的耐受性,其中20%浓度的甲醇,乙醇和丙酮时,仍保留93%以上的活性。AmyH对淀粉的亲和力和最大酶活都较高,其Km=0.94mg/mL, Vmax=208×103U/mg。以Kcat/Km值作为催化效率的参考,AmyH要高于已报道的来源于Nostoc sp. PCC711、Candida Antarctia、和、Pyrococcus furiosus的a-淀粉酶。TLC检测AmyH降解各种寡聚麦芽糖和可溶性淀粉的水解产物显示,AmyH能作用的最小寡聚糖为麦芽七糖,水解淀粉的第一个明显的寡聚麦芽糖产物是麦芽三糖,最终产物为多种低聚麦芽寡糖,这说明AmyH是一个典型的淀粉内切酶。