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目的1.研究PI3K-Akt-FOXO1信号通路在盆腔脏器脱垂(Pelvic Organ Prolapse,POP)患者子宫骶主韧带中的表达及其作用,并初步探讨妊娠、分娩等力学刺激诱导的氧化应激损伤在POP发病中的作用机制;2.利用机械力加载细胞损伤模型,初步探讨机械力对盆底成纤维细胞双向调控作用,并进一步深入研究损伤水平机械力作用可通过磷酸化PI3K-Akt-FOXO1信号通路,诱导氧化应激损伤,下调胶原蛋白表达这一分子机制在POP发病中作用。方法第一部分:收集2013年1月到2015年1月于我院行全子宫切除术患者的骶、主韧带组织,进行如下分组:①实验组:因POP Ⅲ度、POP Ⅳ度行全子宫切除患者20例;②对照组:同期因非POP的其他良性妇科疾病行子宫切除手术患者20例。原代培养盆底成纤维细胞,用Tunnel法检测骶主韧带组织中细胞凋亡情况,用Masson染色、免疫组织化学染色观察盆底主骶韧带组织中胶原纤维及弹性蛋白的含量及形态改变,用免疫组织化学染色检测盆底主骶韧带组织中8-OHdG、4-HNE等氧化应激标记物水平,使用Western-blot检测骶主韧带组织中Akt、p-Akt、FOXO1、p-FOXO1、GPx1、Mn-SOD 等蛋白表达情况。第二部分:使用四点弯曲力学加载仪建立机械力加载细胞损伤模型,利用PI3K-Akt信号通路特异性抑制剂LY294002预处理细胞,根据细胞是否进行加载4mm 4h 0.5Hz机械力作用及LY294002预处理,进行如下实验分组:①4mm 4h 0.5Hz(-)、LY294002(-);②4mm 4h 0.5Hz(+)、LY294002(-);③4mm 4h 0.5Hz(-)、LY294002(+);④4mm4h0.5Hz(+)、LY294002(+)。利用 H2DCF-DA 荧光探针检测细胞内ROS水平,利用细胞免疫荧光法检测细胞内8-OHdG水平,β半乳糖苷酶试剂盒检测细胞衰老,流式细胞仪检测细胞凋亡。使用western-blot检测各组骶主韧带组织中 Akt、p-Akt、FOXO1、p-FOXO1、GPx1、Mn-SOD、COL1A1、等蛋白表达情况,使用Real-time PCR检测各组骶主韧带组织中人Collagen I、GPx1,Mn-SOD基因表达情况。第三部分:使用四点弯曲力学加载仪建立机械力加载细胞损伤模型,根据力学参数不同分为3组:①对照组:不加力组;②1mm4h0.5Hz组;③4mm4h0.5Hz组;对3组实验的人盆底成纤维细胞经不同机械力干预后,使用CCK8检测并比较不同机械力作用对人盆底成纤维细胞增殖活性影响。结果第一部分:在骶主韧带组织中,POP组较非POP组的凋亡细胞比例明显上升(P<0.001),氧化应激标记物8-OHdG、4-HNE表达水平上升(P<0.05);与非POP组相比,POP组中胶原纤维分布疏松,染色较浅。胶原蛋白在两组间表达差异有统计学意义(P<0.05)。POP组中弹性纤维染色较浅,呈碎片状无规则排列,分布稀疏。而非POP组中弹性纤维染色较深,呈规则连续分布,分布较密集。弹性蛋白在两组间表达差异有统计学意义(P<0.05)。与非POP组相比,p-Akt/Akt、p-FOXO1/FOXO1在POP组中表达比例明显上升,GPx1、Mn-SOD表达比例明显下调,有显著统计学差异(P<0.001)。第二部分:在4mm 4h 0.5Hz组中,人盆底成纤维细胞的凋亡细胞、老化细胞的比例较对照组明显上升(P<0.05)。人盆底成纤维细胞内ROS含量明显上升,8-OHdG含量明显上调(P<0.05)。人盆底成纤维细胞内胶原蛋白COL1A1表达明显下调(P<0.05)。与 4mm4h0.5Hz(-)、LY294002(-)组相比,4mm4h0.5Hz(+)、LY294002(-)组中,机械力加载人盆底成纤维细胞10min后,p-Akt表达开始上调,30min后p-Akt水平达到高峰,3h后p-Akt水平回到基线水平。在0-2h内,p-Akt表达水平上调,差异有明显统计学意义(P<0.01)。机械力加载人盆底成纤维细胞30min后,p-FOXO1表达开始上调,1h后p-FOXO1水平达到高峰,4h后p-FOXO1表达回到基线水平。在0-3h内,p-FOXO1表达水平上调,差异有明显统计学意义(P<0.001)。4mm4h0.5Hz机械力加载人盆底成纤维细胞后,可诱导Akt、FOXO1的磷酸化,凋亡、老化细胞比例明显上升(P<0.05),人盆底成纤维细胞内氧化应激水平上升(P<0.05),抗氧化蛋白GPx1、Mn-SOD mRNA及蛋白表达下调(P<0.01);上述作用在4mm4h0.5Hz(+)、LY294002(+)组中均可被LY294002明显抑制,差异有显著统计学意义(P<0.01)。第三部分:不同力学参数加载人盆底成纤维细胞后,与对照组相比,1mm 4h 0.5Hz组细胞增殖活性增强,4mm 4h 0.5Hz组细胞增殖活性减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.妊娠、分娩等力学刺激,可磷酸化人盆底成纤维细胞中PI3K-Akt-FOXO1信号通路,下调抗氧化蛋白GPx1、Mn-SOD表达,诱导氧化应激损伤,从而下调胶原、弹性蛋白表达;2.损伤水平的机械力作用可通过磷酸化激活人盆底成纤维细胞内PI3K-Akt信号通路,磷酸化其下游靶蛋白—转录因子FOXO1,促进其从细胞核到细胞质转位,使其失去转录调控活性,从而抑制ROS清道夫GPx1、Mn-SOD等抗氧化蛋白表达,使机体抗氧化应激能力减弱,可能使POP患者盆底主骶韧带组织内氧化应激-抗氧化应激平衡失衡,从而导致主骶韧带组织氧化应激损伤,诱导细胞凋亡及老化,并下调Ⅰ型胶原蛋白表达,导致POP发生发展,该理论研究成果有望为POP防治提供靶点。3.机械力对盆底成纤维细胞有双向调控作用:适度机械力作用可促进人盆底成纤维细胞增殖,过度机械力作用可造成人盆底成纤维细胞损伤。