丹参作为一种大宗传统中药材,有重要的经济和药用价值,市场需求量极大。随着栽培面积不断扩大,丹参品质问题日益凸显,如何增加活性成分含量从而提高药材品质受到广泛的关注。丹参酮是其主要脂溶性活性成分,丹参酮的生物合成途径正在逐步破译,但生物合成基因的调控网络仍知之甚少,挖掘关键调控因子可为丹参品质改良提供高效靶点,同时为解析丹参品质形成的调控网络奠定基础。课题组前期利用丹参酮生物合成负调控转录因子SmbHLH74为诱饵,酵母双杂筛选丹参cDNA文库,获得了与SmbHLH74互作的一个R2R3-MYB类转录因子:SmMYB38。本研究主要解析了SmMYB38在参与调控丹参酮生物合成过程中的功能以及其分子机制。首先利用酵母双杂交、GST pull-down、Co-IP试验验证了SmbHLH74与SmMYB38的互作关系,进而证明了过表达SmMYB38能够显著的抑制丹参酮的积累情况,进而,利用分子试验技术:RT-q PCR、EMSA、Dual-luc以及Cell-free degradation assay试验,揭示了SmMYB38参与抑制丹参酮生物合成的分子机制。本研究主要试验结果如下:1.前期利用丹参酮生物合成负调控转录因子SmbHLH74为诱饵,酵母双杂交筛选获得了与SmbHLH74互作的一个R2R3-MYB类转录因子SmMYB38,本研究从丹参中克隆了SmMYB38基因,其CDS为897bp,编码298个氨基酸,主要在根中高丰度表达,在茎和叶片中的表达水平很低;亚细胞定位试验表明,SmMYB38定位在细胞核。进而利用酵母双杂交、GST pull-down、Co-IP试验证明了SmMYB38与SmbHLH74在体内与体外互作。2.为了鉴定SmMYB38在调控丹参酮积累中的功能,通过根癌农杆菌和发根农杆菌介导的遗传转化体系获得过表达SmMYB38的丹参转基因植株和毛状根,转基因植物未见明显的表型差异,HPLC试验表明SmMYB38过表达导致毛状根中丹参酮I和丹参酮IIA的含量显著降低。表明SmMYB38负调控丹参酮的积累,可能与其互作蛋白SmbHLH74发挥协同作用。3.为解析SmMYB38抑制丹参酮积累的分子机制,利用EMSA试验证实了SmMYB38可以增强SmbHLH74体外直接结合丹参酮生物合成基因SmCYP76AH1、SmHMGR1、SmGGPPS1启动子的能力;双荧光素酶报告基因试验表明SmMYB38可以增强SmbHLH74直接抑制其靶基因SmCYP76AH1、SmHMGR1、SmGGPPS1启动子的转录活性;利用RT-q PCR证实了SmMYB38过表达材料中SmbHLH74三个靶基因的表达水平均呈现显著下调。Cell-free degradation试验表明SmMYB38抑制26S蛋白酶体介导的SmbHLH74蛋白降解。综上,本研究揭示了SmMYB38通过与SmbHLH74互作,增强SmbHLH74对SmCYP76AH1、SmHMGR1、SmGGPPS1转录的抑制能力以及削弱26S蛋白酶体介导的SmbHLH74蛋白降解,从而负调控丹参酮生物合成的分子机制。