类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以关节滑膜炎症为病理特征的慢性系统性自身免疫病,目前其发病机制尚不明确。大量研究表明,RA发病机制和疾病进程与固有免疫细胞、适应性免疫细胞和成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte,FLS）等各种细胞以及肿瘤坏死因子（tumor neurosis factor,TNF）和前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）等炎性介质共同作用密切相关。色氨酸（tryptophan,Trp）作为哺乳动物体内的必需氨基酸,通过参与蛋白质和核酸合成维持细胞生理活动,以及产生活性代谢物等对机体的免疫调节功能发挥重要作用。机体95%以上的Trp通过犬尿氨酸途径（kynurenine pathway,KP）代谢,已有研究表明KP代谢异常在RA的病理机制中发挥重要作用。色氨酸-2,3-双加氧酶2（tryptophan-2,3-dioxygenase2,TDO2）、吲哚-2,3-双加氧酶1（indoleamine-2,3-dioxygenase1,IDO1）和吲哚-2,3-双加氧酶2（indoleamine-2,3-dioxygenase2,IDO2）是KP第一步骤的限速酶,通过酶促反应将Trp代谢为犬尿氨酸（kynurenine,Kyn）,并进一步产生下游一系列活性代谢物。大量研究表明,IDO1广泛表达于哺乳动物的组织和免疫细胞中,通过调节KP代谢通路以及参与信号通路传导发挥免疫调节作用。但目前TDO2在免疫系统中的作用研究较少。课题组前期研究表明,RA患者滑膜组织中TDO2表达升高,佐剂型关节炎（adjuvant-induced arthritis,AA）大鼠滑膜组织和肝脏中TDO2表达升高,使用TDO2抑制剂680C91能够体外抑制AA大鼠FLS增殖、迁移和侵袭。提示TDO2可能在RA疾病进程中发挥作用。有文献表明,在胶质瘤模型中参与PGE2合成的环氧合酶2（cyclooxygenase-2,COX2）及PGE2受体EP4在转录和蛋白质水平上的表达均与TDO2表达呈相关性。提示TDO2可能通过非酶途径直接参与机体的免疫调节,影响TDO2的表达和酶活性有望成为治疗RA的新策略。但目前对TDO2在RA中组织和免疫细胞中的表达变化以及TDO2对细胞的免疫调节作用尚无报道。目的:1. 明确TDO2在组织中的分布和免疫细胞中的表达情况,分析CIA小鼠组织和免疫细胞中TDO2表达的变化。2.揭示PGE2-EP4-TDO2信号通路对巨噬细胞吞噬功能的调节作用。方法:选用7-8周雄性DBA/1小鼠,免疫组化法检测TDO2在各组织中表达;实时荧光定量PCR（real time fluorescent quantitation PCR,RT-q PCR）法检测组织中TDO2的m RNA表达;流式细胞术检测TDO2在脾脏免疫细胞中的表达;成像流式细胞术检测TDO2在脾脏免疫细胞中的表达定位;流式细胞术鉴定分离培养出的小鼠腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophage,PM）;激光共聚焦法检测TDO2在PM中的表达和分布位置;建立CIA模型进行体重、关节炎指数、胸腺和脾脏指数的统计并使用X射线观察病变部位;HE染色法观察小鼠踝关节、脾脏和肝脏的病理变化;免疫组化法检测CIA小鼠和正常小鼠组织中TDO2表达情况;流式细胞术检测并统计CIA小鼠和正常小鼠的脾脏B细胞、T细胞、自然杀伤细胞（nature killer cell,NK）和树突状细胞（dendritic cell,DC）中TDO2表达;激光共聚焦法和RT-q PCR法检测TDO2在CIA小鼠和正常小鼠PM中的表达;体外设转染TDO2小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）的Raw264.7细胞组、TDO2选择性抑制剂680C91作用24小时后Raw264.7细胞组、EP4激动剂CAY10598作用24小时后Raw264.7细胞组和PGE2不同浓度刺激后Raw264.7细胞组,流式细胞术检测其吞噬功能;RT-q PCR检测EP4和TDO2的m RNA表达;western blot和激光共聚焦检测TDO2蛋白表达;比色法检测Raw264.7上清中Kyn含量用以反应酶活性。结果:1. TDO2在DBA/1小鼠组织中的基因和蛋白表达DBA/1小鼠的淋巴结、胸腺、脑、肾脏、肺、脾脏、肝脏和心脏中均有TDO2m RNA表达。以心脏为对照组,肝脏中表达最高,肾脏中表达最低。免疫组化法显示小鼠的肝脏、脑、肾脏、脾脏、肺、心脏和踝关节中均有明显TDO2蛋白阳性表达。大脑中,TDO2阳性细胞主要分散在海马体周围。肾脏中,TDO2主要在肾小管上皮细胞中表达。心脏组织中,TDO2在整个心肌细胞中均匀表达。在肺泡的间质细胞中,TDO2也存在阳性表达。踝关节中,TDO2主要分布在踝关节的滑膜组织中。脾脏中的小动脉周围淋巴细胞鞘内含有多种免疫细胞,该区域也含有大量的TDO2阳性表达的细胞,2. TDO2在DBA/1小鼠脾脏和肠系膜淋巴结免疫细胞中的表达流式细胞术结果显示,与阴性对照组相比,TDO2在小鼠脾脏的T、B淋巴细胞、DC（CD11c⁺）和NK（CD3^-/CD49b⁺）中明显表达,在小鼠的肠系膜淋巴结的T、B淋巴细胞中均有表达。成像流式细胞术结果进一步验证并显示TDO2主要表达在免疫细胞的细胞质。3. TDO2在DBA/1小鼠巨噬细胞中的表达体外分离培养的PM中CD11b⁺F4/80⁺阳性细胞数达到99%,与阴性对照组相比,TDO2明显表达,主要定位在PM细胞质。4. CIA小鼠的整体指标观察CIA小鼠的关节炎指数在第26天开始增加并在第35-38天达到高峰。X射线结果显示,与正常组相比,CIA小鼠踝关节明显肿胀,关节腔间隙变窄且关节虫噬样改变。体重在第22天开始下降,在第30天体重出现显著性降低。与正常组比较,CIA小鼠的胸腺和脾脏明显肿大,胸腺指数和脾脏指数明显升高。5. CIA小鼠踝关节、脾脏和肝脏的病理学变化与正常组比较,CIA小鼠踝关节滑膜组织异常增生,炎性细胞浸润明显,软骨破坏严重。模型组小鼠脾脏可见红髓增生,生发中心出现,小动脉周围淋巴鞘增生明显且存在炎性细胞浸润。与正常组相比,CIA小鼠肝脏中炎性细胞明显增多。6. TDO2在CIA小鼠踝关节、脾脏和肝脏中的表达免疫组化结果显示,与正常组比较,在CIA小鼠踝关节的滑膜组织、脾脏的动脉周围淋巴鞘以及肝脏的肝细胞中,TDO2阳性表达均明显升高。7. TDO2在CIA小鼠脾脏和肠系膜淋巴结免疫细胞中的表达与正常组相比,CIA小鼠脾脏B细胞（CD19⁺）、浆细胞（CD19^-/CD138⁺）、记忆B细胞（CD19⁺/CD27⁺）、NK和DC中TDO2表达明显升高,脾脏总Th细胞（CD3⁺/CD4⁺）、细胞毒性T细胞（CD3⁺/CD4^-/CD8⁺）、Th17细胞（CD4⁺/IL-¹7⁺）以及Treg细胞(CD4⁺/CD25^+/Foxp3⁺)中,TDO2表达无显著性差异。与正常组比较,小鼠肠系膜淋巴结B细胞中,TDO2表达显著性升高,而在总Th细胞和细胞毒性T细胞中,TDO2表达无显著性差异。8. TDO2在CIA小鼠巨噬细胞中的表达与正常组相比,CIA小鼠PM中TDO2的m RNA和蛋白表达均明显升高。9. TDO2对Raw264.7细胞的吞噬功能和EP4 m RNA表达的影响体外研究选用Raw264.7细胞,与对照组比较,TDO2 si RNA-Raw264.7细胞组和680C91-Raw264.7细胞组吞噬功能显著降低,EP4的m RNA表达水平明显升高。1 0. 激活EP4受体对Raw264.7细胞吞噬功能和TDO2 m RNA表达和活性的影响体外使用选择性EP4激动剂CAY10598处理Raw264.7细胞,与对照组比较,CAY10598组细胞的吞噬功能降低,TDO2的m RNA表达水平和酶活性明显降低。11.不同浓度PGE2刺激对Raw264.7细胞吞噬功能及TDO2表达和酶活性的影响使用PGE2不同浓度刺激24小时后,与对照组相比,PGE2（100n M,1μM,1 0 μM）刺激的Raw264.7细胞吞噬能力明显降低,TDO2表达和酶活性同样降低。结论:1.TDO2在DBA/1小鼠的心脏、脑、肾脏、肺、脾脏、肝脏和踝关节中存在表达。TDO2在DBA/1小鼠的免疫细胞中表达,包括:T、B淋巴细胞、PM、DC和NK,主要分布在细胞质。2.与正常组相比,CIA小鼠的踝关节、脾脏和肝脏中TDO2表达明显升高,脾脏的B细胞、浆细胞、记忆B细胞、NK和DC中,TDO2表达升高;脾脏总Th细胞、细胞毒性T细胞、Th17细胞以及Treg细胞中TDO2表达无显著性差异。3.巨噬细胞中TDO2表达与酶活性与其吞噬功能成正相关,与EP4表达水平成负相关,PGE2通过刺激EP4表达降低TDO2的表达和酶活性,降低巨噬细胞的吞噬功能。