原花色素(proanthocyanidins简称PC)是一种以黄烷醇为主要结构单元,以不同连接方式聚合而成的复杂的多酚类植物次生代谢产物,水果是膳食PC的最主要来源。研究表明,PC具有很强的抗氧化、消除自由基、抗高血压、抗肿瘤等一系列重要生理作用,其生理作用及消化吸收率与它的平均聚合度密切相关。目前水果中PC含量分析方法有分光光度法和HPLC法,前者系统误差较大,而后者不能给出总含量和平均聚合度的信息。近年一些酸解-衍生化高效液相色谱法已经用于一些水果样品中PC的含量和平均聚合度的分析,但是这些结果都存在着分析品种单一,标准品不全等缺点。针对这些不足,本项研究对新方法进行了较系统的开发、评价和大量实际样品分析试验。对PC的酸解-苄硫醇衍生反应条件进行了研究,考察了苄硫醇试剂浓度、酸的配比和浓度、反应时间、反应温度等条件对衍生反应的影响。最后确定在PC溶液浓度不超过0.4%的水平下,反应液中苄硫醇的浓度为1%;冰乙酸:1 M盐酸= 5:1(v/v),反应温度为90℃,反应时间为60 min。此条件可以保证PC聚合体能够被彻底降解生成相应的黄烷醇及其苄硫醇衍生物。以工业品葡萄籽提取物为原料,通过酸解-苄硫醇衍生反应、正相HPLC、反相HPLC等步骤制备纯化了表儿茶素-苄硫醚(EC-S)和没食子酸表儿茶素酯-苄硫醚(ECG-S)两种衍生物。正相色谱分离条件为:色谱柱SinoChrom SiO2 (250 mm×20 mm i.d, 10μm),流动相:乙酸乙酯:石油醚(60:40,v/v),流速:10 mL/min,检测波长:280 nm。反相色谱分离条件为:色谱柱SinoChrom ODS-BP (250 mm×20 mm i.d, 10μm),流动相:70%(v/v)的甲醇(0.05%甲酸),流速10 mL/min,检测波长:280 nm。采用LC-MS法、1H和13C高分辨率二维NMR图谱方法对其进行了结构和纯度分析,结果表明,制备的两种成分确实为目标化合物。建立了水果中PC含量和平均聚合度的HPLC分析方法,其色谱条件为:Hypersil BDS C18分析柱(250 mm×4.6 mm i.d., 5μm);流动相A:500μL/L的甲酸水溶液;B:甲醇:乙腈= 1:2,含500μL/L的甲酸。梯度程序(min/B%)为:0/13,8/13,16/40,24/50,27/100,34/100,37/13,45/13。紫外检测器的检测波长为:280 nm;流速为:0.8 mL/min;柱温:35℃;进样量:5μL;峰面积外标法定量。分别统计没食子酸(GA)、儿茶素(CT)、表儿茶素(EC)、没食子酸表儿茶素酯(ECG)、EC-S、ECG-S的峰面积,通过标准曲线求出各种单体的含量和PC总含量,再由黄烷醇单体与衍生物的总浓度/黄烷醇单体浓度,即(CCT+CEC+CECG+ CEC-S +CECG-S)/(CCT+CEC+CECG),计算出样品中的PC平均聚合度。对山楂、葡萄等实际样品进行测定,各成分间有良好的分离,重复定量分析的相对标准偏差在0.4%～4.2%之间,最低检出限为:0.4 ng～4 ng之间,线性范围在0.8 ng～4000 ng之间,回归方程的相关系数达到0.9992～0.9999,45分钟内可以完成一次样品分析。采用开发的新方法对葡萄、苹果、山楂及其加工制品中的PC含量和平均聚合度进行了分析,结果表明,红星、金矮生、乔娜金、王林和富士5个品种的苹果中PC总含量范围为:0.14 mg/g～0.26 mg/g,平均聚合度为2.0～2.78;坂田、京亚、田康、计选、前锋、巨峰、漠王, 7个鲜食葡萄品种的籽中原花色素总含量范围为5.2 mg/g～26 mg/g,平均聚合度在2以下;对曾芳德、赤霞珠、梅辰、轭西拉、黑品乐、琼瑶浆、长相思、米勒、宝石、白思南、雷司令、美荣12种酿酒葡萄品种的葡萄籽中的PC进行了分析,PC总含量为8.4 mg/g～32 mg/g,平均聚合度为1.8～4.0;对一种葡萄籽提取物工业产品进行了分析,PC总含量为370 mg/g,平均聚合度为6.08;6种市售保健品中,PC总含量为6 mg/g～51 mg/g,平均聚合度在2.70～4.30之间。山楂鲜果中原花色素总含量为4.8 mg/g,平均聚合度为1.9;汇源山楂果汁、华旗山楂果汁中PC含量分别为0.065 mg/L和0.11 mg/L;而山楂糕、山楂羹、山楂片、果丹皮4种山楂加工制品中,PC含量为1 mg/g～2.4 mg/g,6种产品PC平均聚合度在1.77～2.23之间。本项研究还对干制和贮存过程中山楂PC的稳定性进行了研究。结果表明:真空冷冻干燥、80℃热风干燥和自然干燥三种干制条件干燥条件中,真空冷冻干燥后PC成分的损失最小,其总量的保存率为88%;热风干燥和自然干燥后PC成分的保存率分别为76%和25%。鲜果的冷藏试验结果表明,在0℃条件下经过110 d的贮存,山楂鲜果中的原花色素总含量相当于贮存初期含量的80%,好果率、色泽均符合正常标准。同山楂果的干制结果进行比较可以看出,鲜果低温冷藏PC成分损失率较低,适用于山楂原料的短期贮存,干制方法可用于长期贮存。本实验建立的用于分析水果中PC的酸解苄硫醇衍生HPLC法,以制备的EC-S、ECG-S衍生物等为标准对照品,具有操作简单准确快速等优点,不仅可以测出PC成分的总含量,而且还可以提供PC聚合程度的重要信息,可用于苹果、葡萄、山楂及其提取物、相关工业品以及保健食品的分析和质量评价。从实际样品分析结果可以看出,不同品种之间无论从PC含量还是平均聚合度都有较大的差异。山楂果实中PC含量较高,甚至接近葡萄籽提取物保健品中的含量,而其平均聚合度却明显低于所分析的保健品,因此是一种良好的水果PC资源。