龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是我国南方重要的热带亚热带木本果树,其胚胎发育状况与其果实的产量及品质密切相关。植物胚胎的发育是一个细胞分化的过程,该过程中必然有氧化胁迫的影响,而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)作为抗氧化系统的第一道防线在植物胚胎的细胞分化和发育过程中起着重要作用。本研究利用龙眼体胚发生模式实验系统,在进行龙眼体胚发生过程SOD的生理生化研究的基础上,进一步进行SOD基因家族克隆及表达调控机制研究(启动子分离与功能鉴定、miRNA分离与鉴定以及相关基因和miRNA定量表达分析等),以探讨在龙眼体胚发生中SOD的作用的分子机制,并为龙眼活体胚胎发育中的SOD作用机制提供参考。主要结果如下:1.龙眼体胚发生过程中SOD酶活性变化及同工酶分析在本研究中首先对龙眼活体晚期胚胎和早期离体胚胎中的SOD活性及同工酶谱进行了初步分析。结果发现,不管是龙眼晚期活体胚胎或早期离体胚胎,随着龙眼胚胎的进一步发育,SOD的活性均呈逐渐升高趋势,说明SOD对胚性细胞的分化以及晚期胚胎发育具有促进作用。温度处理对龙眼体胚发生早期SOD活性影响较小,而对SOD同工酶谱影响较大,表现为谱带的出现与消失,其中25℃处理的龙眼胚性培养物,SOD同工酶谱条带数最多,而20℃和30℃处理的材料,表达较弱的酶谱条带消失。提示SOD活性与同工酶谱的规律变化与龙眼体胚发生早期细胞分化、超氧自由基的清除以及促使体胚正常发育有密切关系。2.龙眼胚性愈伤组织SOD基因家族cDNA和DNA全长的获得在酶活性测定的基础上,利用RT-PCR和RACE法从龙眼胚性愈伤组织中获得SOD基因家族20个不同mRNA转录本,它们分别编码细胞质DlCSD1a和DlCSD1b、叶绿体DlCSD2a、叶绿体DlFSD1a、DlFSD1b及线粒体DlMSD等,这是木本植物SOD首次克隆较为完整的,也是植物体胚SOD基因分离较为完整的;SOD基因家族各成员的3’UTR序列的长度都具有多态性,可能与miRNA的转录后水平调控相关;此外,还获得了DlCSD1a-4、DlCSD1a-5、DlCSD1b- variant1和DlFSD1b-variant1~ DlFSD1b-variant4等7个不同的可变剪接体,它们发生剪接的位置不尽相同,并存在各自不同的剪接模式。DlCSD1a基因基因组序列长2741 bp,含8个内含子;DlCSD1b基因长4592 bp,含6个内含子;DlCSD2a基因长3727 bp,含7个内含子;DlFSD1a基因长2171 bp,含6个内含子;DlFSD1b基因长2137 bp,含7个内含子;DlMSD基因长1589 bp,含5个内含子;所有内含子的剪切位点均符真核生物GT-AG规则。不同基因所含内含子和外显子的长度不一,其中DlCSD1b的第5个内含子、DlCSD2a的第6个内含子的长度较长,分别为3539 bp和2178 bp,长内含子的存在可能有利于产生多种mRNA分子,编码出多种功能的蛋白质。3.龙眼胚性愈伤组织SOD基因家族生物信息学分析根据生物信息学分析结果,龙眼胚性愈伤组织DlSODs编码的蛋白质不同成员均含有SOD典型的保守结构域,属于超氧化物歧化酶大家族的不同成员,它们在进化上具有高度保守性,在功能上也具有较大相似性,均为亲水的酸性蛋白,除DlFSD1a和DlFSD1b外,其余均为稳定蛋白。不过不同类型的SOD又具有各自特点,它们在龙眼体胚中的可能作用机理:①DlCSD1a和DlCSD1b定位于细胞质,不含信号肽,不进行跨膜运动,两者相互协调主要负责细胞质中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主和苏氨酸的位点为辅发生磷酸化;②DlCSD2a定位于叶绿体,含有信号肽,以由叶绿体内膜到叶绿体外膜上方式进行跨膜运动,主要负责叶绿体细胞中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主和苏氨酸为辅的位点发生磷酸化;③DlFSD1a定位于叶绿体,含有信号肽,不含跨膜结构域,可能与DlCSD2a协同作用负责叶绿体细胞中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主、苏氨酸及酪氨酸为辅的位点发生磷酸化;④DlFSD1b和DlFSD1b(JF316733)可能定位于过氧化物酶体和细胞质,均不含信号肽,含2个跨膜结构域,倾向于由外到内进行跨膜运动,并以酪氨酸为主、丝氨酸及苏氨酸为辅的位点发生磷酸化;⑤DlMSD定位于线粒体,不含信号肽,存在从线粒体内膜到外膜或从外膜到内膜的双向跨膜运动的2个跨膜螺旋结构域,主要负责线粒体细胞中活性氧等的清除,并以丝氨酸为主、苏氨酸及酪氨酸为辅的位点发生磷酸化。4.龙眼胚性愈伤组织SOD基因家族启动子克隆和功能鉴定为进一步了解SOD基因家族在转录水平上的调控作用,本研究采用Tail-PCR法和IPCR法,分别获得了DlCSD1a、DlCSD2a、DlFSD1a和DlMSD基因启动子序列,长度分别为2252 bp、164 bp、1080 bp和843 bp,其中,DlCSD1a启动子区域含有2个内含子序列。利用RLM-RACE法鉴定DlSODs基因家族的TSS,结果显示它们都含有丰富的TSS,数量从3 ~ 10个不等;5’UTR长度波动范围较大,介于11~193 bp之间;TSS碱基组成一般以A为主,其次为G和C,还少数出现T。龙眼DlSOD基因家族不同成员存在多个TSS且各TSS起始mRNA转录效率不同,暗示RNA聚合酶和调控因子在DlSOD基因家族启动子的一个较宽范围内的互作控制了转录的效率。PlantCare软件分析显示,DlCSD1a、DlCSD2a和DlFSD1a基因启动子区域中,均含有核心启动子元件和基本启动子区,但DlMSD基因5’端基础启动区缺少TATA和CAAT盒;此外,还存在大量与光响应、激素应答、环境胁迫响应、胚乳特异表达响应、细胞周期相关响应及大量的功能未知或功能特异的相关元件;另外不同成员SOD基因还存在各自功能特异的顺式元件。此外,DlCSD1a和DlFSD1a基因可能受bZIP类转录因子调控,而DlMSD可能受WRKY类转录因子的调控。在此基础上,还构建它们3’/5’不同缺失突变体的瞬时表达载体,为将来功能验证实验奠定基础。5.龙眼体胚发生过程中调控SOD基因家族的小分子RNA的分离与鉴定为了解DlSODs基因在转录后水平上的表达调控机制,本研究首先采用Solexa技术对龙眼体胚发生过程中的sRNA进行测序。结果表明:共得到Unique序列6,553,782条,其中仅13,151条序列与已知miRNAs相似;sRNA以24 nt的长度为主要存在方式;龙眼体胚发生过程中miRNA的表达丰度存在巨大差异,其中大部分为低丰度表达;总共鉴定了367个保守miRNA,构成众多家族,不同家族间成员数量存在巨大差异;另外获得23个候选的新miRNA,其中有10个miRNA含单个基因座,另13个miRNA具备多个基因座。在上述基础上,结合psRNA Target预测软件和RLM-RACE法最终鉴定到调控DlSODs的11个dlo-miRNAs,它们以裂解DlSODs mRNA的方式调控其在龙眼体胚发生过程中的转录后水平表达。这11个dlo-miRNAs分别是dlo-miR156(靶标DlCSD1a);dlo-miR159、863-3p、1023b-3p、1223和2643(靶标DlCSD1b);dlo- miR159、398、1171a和1171b(靶标DlCSD2a)以及dlo-miR808和2089(靶标DlFSD1a),它们在龙眼体胚发生过程中呈较大差异表达,推测其差异表达导致了不同类型SOD基因在龙眼体胚发生过程中表达模式的不同。此外利用RT-PCR法克隆获得pre-miR398a/b序列,它们与其它植物的前体序列具有高度保守性。6.龙眼体胚发生过程中SOD基因家族及miRNA定量表达分析①龙眼体胚发生过程中SOD基因家族表达模式分析在上述研究的基础上,以及对龙眼体胚发生过程中qPCR内参基因筛选的基础上,对不同类型DlSODs的表达模式进行分析。首先,不同类型DlSODs在龙眼体胚发生过程中的表达变化趋势比较接近,它们主要在体胚发育的中期和成熟胚中起作用。从松散型胚性愈伤组织开始到成熟胚等9个阶段,它们总体的表达变化趋势主要体现为“递增(胚性愈伤II)-递减(不完全胚性紧实结构)-递减(紧实胚性球形结构)-递减(球形胚)-递增(心形胚)-递减(鱼雷形胚)-递减(子叶形胚)-递增(成熟胚)”模式。其次,不同类型SODs在龙眼体胚不同发育阶段有明显的分工。在胚性愈伤组织II和心形胚阶段,所有类型SOD都介导了其发育;球形胚阶段的形态建成则主要由DlCSD1a-5和DlCSD1b-2负责;鱼雷形胚阶段的发育主要受DlFSD1a、DlFSD1b和DlMSD的调控;在子叶形胚阶段,所有类型SODs的转录水平均很低;在成熟胚阶段的形态建成则主要以DlCSD1a为主,DlMSD为辅负责。此外,还研究了DlSODs基因家族与其它抗氧化系统的相关基因CAT和POD和分子伴侣DlCCS之间表达模式的相互关系,表明CAT、POD等抗氧化系统相关基因与DlSODs的相互协调表达,从而保证了ROS网络的正常运行;DlCCS的正常稳定表达对维持DlCSDs正常发挥生物学功能是必须的,但DlCSDs的激活也并不完全依赖于DlCCS的存在。②龙眼体胚发生过程中miRNAs表达模式分析在龙眼体胚发生过程中qPCR miRNA内参基因筛选的基础上,对20个dlo-miRNAs的表达模式进行分析。dlo-miR3,5,10,12,13,156a,156c,397a,398b.1,398b.2,398b.3,808和2089*等miRNA共同介导了龙眼体胚发生早期的形态建成,它们均在体胚发生早期球形胚之前大量表达,晚期表达量多数下降,部分miRNA甚至不表达;dlo-miR6、160a和167a可能在龙眼体胚发生的中晚期起主要作用。dlo-miR6、160a转录水平的累积对龙眼心形胚和鱼雷形胚的形态建成可能是必须的;dlo-miR167a在龙眼子叶胚和成熟胚中起主要作用;而dlo-miR159a.1、159a.2、159c和159f在龙眼体胚发生过程中的表达均比较稳定。以上说明miRNAs表达的组织和时空特异性共同介导了龙眼体胚的发生。③龙眼体胚的发生过程miRNA与DlSODs表达模式的比较分析miRNA-DlSODs的协调表达参与调控了龙眼体胚的发生。对miRNA与DlSODs表达模式进行比较分析表明:dlo-miR156家族、159家族、398b家族、808和2089*在龙眼体胚发生过程中均有特异性扩增,且表达量能与相应靶基因呈负相关;然而dlo-miR863-3p、1023b-23p、1171a/b、1223和2643却未能得到特异性扩增但却能鉴定到它们裂解的mRNA片段,提示在龙眼体胚中可能还存在其它潜在的miRNA或内源siRNA介导了DlSODs的表达。此外,不同miRNA成员间在不同发育阶段具有明确的分工,甚至不同miRNA成员可能控制着相应mRNA转录本的表达,如dlo-miR159家族的4个成员分别调控着DlCSD1b、DlCSD2a不同发育阶段的表达。在龙眼体胚发生早期(球形胚前),它们的表达主要由dlo-miR159a.1负责;从球形胚到心形胚则由dlo-miR159c和159f负责;心形胚到成熟胚阶段由dlo-miR159a.2和dlo-miR159c负责,这种现象还在dlo-miR156家族及398b家族出现。这可能提示当miRNA某个成员不能裂解mRNA表达时,另外一些成员则对其功能进行互补,从而实现对靶基因转录后水平的调控。dlo-miR159同时介导DlCSD1b和DlCSD2a的表达,并负责协调不同靶基因间的表达变化趋势;miRNA可能以裂解靶基因mRNA的降解或抑制靶蛋白质翻译两种调控机制并存的方式同时介导靶基因的表达。此外,dlo-miR398b与pre-miR398b的表达模式基本一致,它们与靶基因DlCSD2a的表达模式刚好相反,说明前体miRNA能在一定程度上反应成熟miRNA的表达情况。综上所述,龙眼体胚发生过程中DlSODs的表达调控机制可能是:当外界环境因子发生改变时(内源激素或外界环境因子胁迫),细胞内活性氧水平发生变化,进而启动相关调控因子[(转录因子bZIP、WRKY、miRNAs(dlo-miR156、159、398、808和2089*)、磷酸化作用)]转录水平的变化从而调控DlSODs的表达,使之最终参与龙眼体胚发生过程中的基础代谢、激素信号转导、细胞凋亡、氧化胁迫等生理过程,从而最终影响其发育的整体进程。总之SOD的表达是多种因子共同构成的一个复杂调控网络。