空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni,C.jejuni)为革兰氏阴性菌,是近十几年来受到国内外学者广泛重视的一种重要的人兽共患病原菌。其中,鞭毛及其介导的运动性被认为是该菌重要的毒力因素。目前,空肠弯曲菌鞭毛结构已被广泛研究,但对其基因合成及调控机制知之甚少。其中,FlhF是影响空肠弯曲菌鞭毛合成以及运动力的关键蛋白,其失活导致鞭毛及运动力完全缺失,具体影响机制并未阐明。考虑FlhF对鞭毛合成的重要性,推测FlhF对鞭毛合成除了间接调控作用,还可能作为一个转录因子,直接调控鞭毛基因表达,但FlhF转录功能及机制也未见报道。本研究成功构建flhF缺失株和回复株,以及B、N、G结构域回复株,通过运动力实验及透射电镜观察进一步分析FlhF蛋白结构域对鞭毛合成的影响;利用转录组测序技术探究了 FlhF在鞭毛合成通路中影响效应;利用EMSA、ChIP-qPCR及LacZ报告质粒检测实验等技术筛选并验证FlhF转录调控靶标,进一步解析FlhF在空肠弯曲菌鞭毛合成中的转录调控通路。一、空肠弯曲菌FlhF蛋白结构域对鞭毛合成的影响分析FlhF蛋白具有B、N、G 3个结构域。为探究FlhF蛋白结构域对鞭毛合成的具体影响,本文构建了flhF缺失株和回复株,以及B、N、G结构域回复株。以空肠弯曲菌81-176基因组DNA为模板,PCR方法扩增flhF上下游各约 1000 bp基因;以质粒pRY107为模板扩增kanr抗性基因。进而将其一步法连接至pMD-19T(Simple)载体上,成功构建自杀载体pMD19T-flhF-kanr。利用同源重组,将该重组质粒电转至空肠弯曲菌感受态细胞后,自杀载体上的目的片段会和基因组上相应基因片段发生同源交换,最终成功得到flhF缺失株。进一步构建flhF以及B、N、G单结构域回复株,首先扩增flhF基因及其B、N、G domain片段,通过酶切连接方式分别将目的基因连入课题组前期保存的穿梭载体pUOA18-PmetK中以获得pUOA1 8-PmetK-flhF及pUOA18-PmetK-B/N/G domain回复突变载体。将回复突变载体通过三亲本接合方法导入flhF突变株中,进一步获得空肠弯曲菌flhF与B、N、G domain回复株。通过运动力实验及透射电镜观察实验发现,flhF缺失后运动力及鞭毛完全缺失,而分别回复B、N、G结构域均不能恢复鞭毛及运动表型。为进一步探究各结构域对于flhF功能的影响,同时回复双结构域,PCR方法扩增B、N、G domain片段,通过拼接PCR方法形成BN、NG、BG片段,同回复株构建方法相同,将目的片段连接至pUOA18-PmetK载体,并通过三亲本接合方法形成BN、NG、BG结构域回复株,利用运动力实验及透射电镜观察发现,双结构域仍然不能回复鞭毛及运动力表型。这表明FlhF蛋白的任何一个结构域对于其在鞭毛合成中发挥功能都至关重要。二、空肠弯曲菌FlhF在鞭毛合成中转录调控通路解析考虑FlhF在鞭毛合成中重要性,推测FlhF除了前期报道的间接调控外,还可能直接调控鞭毛基因转录表达。本研究通过RNA-Seq进一步分析FlhF对鞭毛基因转录水平的具体影响,本文利用前期构建的flhF缺失株及81-176野生株,通过荧光定量PCR方法探究鞭毛基因表达相对高的时间点,并进行RNA-Seq实验分析。研究结果显示空肠弯曲菌野生株在体外培养8h时的生长状态良好,且大部分鞭毛基因相对表达较旺盛。RNA-Seq分析显示,共获得99个具有显著差异表达的基因(Foldchange>2,P<0.01),其中鞭毛基因占26%(26个)。将所有鞭毛基因按照转录级联层次及功能相关性进行分类,并进行深入聚类分析发现FlhF在鞭毛系统中作为全局调节子,整体影响鞭毛基因下调表达,与其他基因比较,鞭毛钩相关基因以及Ⅱ类鞭毛基因的转录呈现显著下调表达。为进一步探究FlhF对于鞭毛基因转录表达影响,本研究从RNA-Seq结果中随机选择了 6个显著性变化的鞭毛基因,包括fliK,flaB,flgE,flaA,flgL及flgI,将其启动子进行FAM-S荧光标记,通过EMSA实验发现,FlhF可与flgI启动子结合进而正调控flgI基因的表达,ChIP-qPCR验证该结果。为了进一步探究FlhF在PflgI上的具体结合位点,将flgI启动子分为六个片段,以FAM-S标记扩增,同时连接到pMW10载体上以构建LacZ重组报告质粒,通过EMSA以及β-半乳糖苷酶测定实验探究发现,FlhF在PflgI上的具体结合序列为“AAGAAATTTGGATCAACTAGCTTAAG”。为进一步探究FlhF是否通过直接调控调节鞭毛合成过程中的关键调控因子(RpoD,RpoN,FliA,FlgSRTCS)从而起到整体调控作用,利用EMSA及β-半乳糖苷酶测定实验发现,FlhF可与rpoD,fliA,flgS的启动子结合。因此,提出FlhF可能转录调控机制模型,FlhF可能通过结合rpoD,fliA的启动子,从而直接调控σ70和σ28依赖的鞭毛Ⅰ类和Ⅲ类鞭毛基因的表达,同时通过结合flgS的启动子,影响FlgR磷酸化,进而刺激σ54因子,间接调控二类基因的表达。此外,FlhF也可直接调控特定鞭毛Ⅱ类基因flgI的转录表达,最终在鞭毛合成过程中起到整体调控功能。