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研究目的:急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指在严重感染、休克、创伤及烧伤等非心源性疾病过程中,肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿,导致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。目前认为其发生的机制为瀑布性炎症反应导致的肺损伤,其中凝血和纤溶紊乱也参与急性肺损伤的病程,早期促凝机制增强,而纤溶过程受到抑制,引起广泛血栓形成和纤维蛋白的大量沉积,在急性肺损伤的发生和发展中起到重要的作用[1]。ALI /ARDS的治疗是一个全身的综合性的治疗,尽管保护性通气策略使其死亡率有所降低,但其发病率和死亡率仍然很高。为寻求新的特异性的治疗手段,目前许多研究者开始把目光转向在ALI/ARDS发病机制中有重要意义的细胞因子、纤溶系统的异常。近期的研究对纤溶与炎症之间潜在的相互作用得到了进一步的认识,结构和功能研究也越来越多地显示纤溶系统和炎症之间存在密切联系,可能共同促进了急性肺损伤的发生发展。有研究显示核因子-κB(NF-κB)通路的激活是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)分泌的重要通路之一。Takeshita等[12]体外实验发现TNF-α通过NF-kB介导细胞PAI-1mRNA的表达,另有研究发现[13]生长素释放肽(Ghrelin)通过抑制NF-kB而抑制TNF-α诱导PAI-1mRNA的表达。应用Ghrelin有可能降低ALI/ARDS中的炎症反应和改善纤溶状态。Ghrelin是近年来发现的一个由28个氨基酸组成的脑肠多肽,主要来源于胃[14],是生长激素促泌素受体,研究证明Ghrelin及其受体存在于全身多处,决定其功能的多样性,由于Ghrelin及其受体在肺组织的表达表明其可能具有治疗肺部疾病的功能,研究者们对于Ghrelin功能进行了广泛的研究,用Ghrelin治疗脓毒症诱导ALI成为新的研究热点。最近在国外将Ghrelin应用于脓毒症的相关研究中发现。Ghrelin可能通过NF-κB途径降脓毒症诱导ALI/ARDS小鼠血浆中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子,增加肺血流量,改善肺组织,减轻肺水,提高生存率。但国内仍没有类似的报道,而且对于Ghrelin在治疗脓毒症上没有提供一个最佳治疗剂量,而Ghrelin治疗ALI的纤溶作用只限于体外实验。目前还没有相关的动物实验证实Ghrelin是否通过减低NF-κB介导TNF-α表达PAI-1,它在治疗ALI机制还要进一步探讨。因此,我们使用不同浓度Ghrelin对CLP介导肺损伤中细胞因子的调节效应,观察其能否降低肺血管通透性,减轻肺损伤的严重程度,寻找一个最佳治疗组。同时,将观察Ghrelin对NF-κB的表达和PAI-1、t- PA分泌是否有影响,探讨其可能的作用机制。为临床治疗提供一定的理论依据。研究内容与方法:第一部分:生长素释放肽干预对CLP介导急性肺损伤小鼠的保护作用1.随机将昆明小鼠分为正常组(NS)、假手术组(Sham)、盲肠结扎穿孔组(CLP)和Ghrelin干预组(Ghrelin+ CLP);再将Ghrelin干预组分成5nmol/kg、10nmol/kg、20nmol/kg、40nmol/kg、80nmol/kg五个剂量组,分别用A、B、C、D、E表示。而每个剂量组分别在CLP后5h、10h、15h时间段分次腹腔注射Ghrelin。2.CLP组、Ghrelin干预组20h后处死小鼠、取样,正常组、假手术组则给予腹腔注射生理盐水(2.5 ml/kg)观察20小时,处死小鼠,取样,测定和比较各组的损伤指标,,包括肺湿/干重比值、肺水含量、肺组织水通道蛋白测定,血清炎症介质以及组织病理学评分,评估小鼠肺损伤,计算生存率。第二部分:生长素释放肽干预对CLP的机制---NF-κB信号通路和纤溶系统1.免疫组化测定肺组织NF-κB的表达。2.ELISA测定血浆PAI-1和t–PA水平,计算t–PA/PAI-1比值。结果:第一部分:生长素释放肽对CLP介导急性肺损伤小鼠的保护作用1.Ghrelin干预对CLP诱导ALI/ARDS小鼠肺血管通透性的影响:1.1.Ghrelin各干预组肺水含量显著低于CLP组(P<0.001),Ghrelin干预C组肺水含量最少,但高于正常组和假手术组。Ghrelin干预C组肺湿/干重比值显著低于CLP组(P<0.001),但较正常组和假手术组高。1.2. Ghrelin干预C组水通道蛋白AQP1、AQP4的水平表达显著高于CLP组,但低于正常组和假手术组。1.3. CLP组肺组织学损伤评分明显高于正常组和假手术组,达到ALI标准,Ghrelin干预C组的肺组织病理显示肺组织损伤较CLP减轻。2.Ghrelin干预组对CLP诱导ALI小鼠血清炎症介质的影响: ELISA结果显示:Ghrelin干预组血清TNF-α水平均显著低于CLP组,B组有统计学意义(P<0.05)、C、D、E组有统计学意义(P<0.001),Ghrelin-C组IL-6,IL-1β水平均显著低于CLP组(P<0.001),但较正常组和假手术组高。3.Ghrelin干预组对CLP诱导ALI小鼠生存率的影响: CLP组在手术后7天内全部死亡,与正常组、假手术组、Ghrelin-C组的平均生存时间明显差别(P<0.001),Ghrelin-C组有3只小鼠存活生存时间超过10天,采用Kaplan-Meier Survival分析Ghrelin对CLP小鼠存活率的影响,与CLP组相比Ghrelin干预C组的存活时间则显著延长,存活率显著提高20%(P<0.05),Ghrelin干预CLP小鼠后生存率得到改善。第二部分:生长素释放肽干预对CLP的机制---NF-κB信号通路和纤溶系统1.免疫组化结果显示:与正常组、假手术组相比,CLP组肺组织NF-κB表达显著增强, Ghrelin干预C组的NF-κB表达强度比CLP组弱,与其减轻肺损伤相关。2. ELISA结果显示:与正常组、假手术组相比,CLP组t-PA水平轻度增高、PAI-1水平明显增高,t-PA /PAI-1比值明显下降,与ALI时纤溶抑制有关。与CLP组相比,Ghrelin-C组血浆t- PA水平轻度升高(P<0.05)、PAI-1水平明显下降(P<0.001)、t-PA /PAI-1比值明显增高(P<0.001),与Ghrelin提高纤溶活性有关。结论:1.Ghrelin具有抗炎和减低肺血管通透性作用,可显著提高CLP小鼠的存活率,干预组C组(20nmol/Kg)疗效最好,提示应用Ghrelin可能有助于改善ALI的预后,。2.Ghrelin可能通过NF-κB途径减轻CLP介导的急性肺损伤炎症反应,提高纤溶活性。