研究背景:自1844年报道第一例骨髓瘤患者的二十年来,多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)的治疗也取得了很大的进展,但是MM仍然是不可治愈的恶性浆细胞增殖的血液肿瘤,位列第二大血液系统疾病(第一是非霍奇金淋巴瘤)。近年来,随着人口老龄化MM发病率不断上升,发病年龄的中位数为64岁。常见的症状有溶骨性病变、贫血、肾功能损害和感染等,严重影响了患者的生活质量,目前确切的诱发病因及发病机制仍不清楚。在近二十年里,出现了许多新的疗法与治疗药物,如:蛋白酶体抑制剂、单克隆抗体、免疫调节药物以及骨髓移植和嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,CAR-T)治疗。临床上的治疗方案多为多药联合使用,且联合地塞米松(dexamethasone,Dexa)药物的方案在MM的治疗中得到广泛应用。50多年前Dexa被用于MM的治疗,Dexa可以抗炎并可以迅速杀伤淋巴系统的肿瘤细胞,在治疗MM中起着重要的作用,如今患者对Dexa耐药已成为棘手的问题,对Dexa耐药的患者往往预后不良,且生存时间会明显缩短。因此,急需要开发新的药物来克服MM的耐药性。已有文献报道青蒿素及其衍生物与其他抗肿瘤药物联合使用能起到化疗增敏的作用,从而克服肿瘤耐药,但是其在MM中的作用还未见文献报道。目的和意义:青蒿素(artemisinin,ART)及其衍生物双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)在抗肿瘤中都有广泛的研究,在多发性骨髓瘤中研究甚少,更没有ART和DHA在抗肿瘤研究中的比较。青蒿素类药物能否克服MM相关药物的耐药或者能否增加MM相关药物的敏感性?因此,作为既具有抗肿瘤活性,又能增加现有药物敏感性的青蒿素类药物,成为了MM治疗的重要备选药物之一,其对MM的作用效果及作用机制急需进一步验证。研究方法:基于5TMM3VT骨髓瘤模型小鼠以及骨髓瘤细胞株ARP1和H929,我们比较ART和DHA对MM的作用差异。我们通过流式细胞术、耗氧量实验、Western blot等方法分别检测相同剂量下ART和DHA对细胞周期、ROS(reactive oxygen species)、二价铁、细胞氧消耗量及相关通路的影响差异,揭示其分子水平和重要通路的差异机理。紧接着,为研究对DHA能否克服硼替佐米、Dexa耐药我们首先将DHA分别作用于硼替佐米的一对敏感和耐药细胞株RPMI 8226.WT和8226.DR以及Dexa的一对敏感和耐药细胞株MM.1S和MM.1R,用MTT实验验证联合用药指数。同时将药物联合后作用于病人原代CD138+细胞,确定其疗效。通过流式细胞术、显微成像、Western blot等方法分别检测联合用药后细胞凋亡、ROS、线粒体膜电位及相关通路的变化。最后,我们用小鼠异种移植实验体内验证联合用药前后对小鼠肿瘤的生长状况的影响,进一步揭示DHA是一个潜在的治疗MM的药物。实验结果:体内实验结果表明与对照组相比,ART和DHA均能显著提高5TMM3VT骨髓瘤模型小鼠的生存率;与ART组相比,DHA作用于小鼠后,小鼠的存活率和存活时间均显著提高。体外MTT和凋亡实验结果显示,DHA更能显著的抑制MM细胞的生长,并引起MM细胞凋亡。细胞周期实验结果显示给予DHA的MM细胞株G2/M期明显低于给予ART组和对照组。流式检测细胞ROS结果显示与ART组相比,DHA使MM细胞产生了更多的ROS,同样细胞二价铁离子水平在DHA的作用下也升高了。O2R检测细胞耗氧量实验结果显示DHA增高了 MM细胞的耗氧量。Western blot结果显示MM细胞给予DHA后比ART组更能引起cleaved caspase 3的升高,引起Bcl-2和Bad的降低。MTT结果显示,DHA不能克服硼替佐米耐药株的生长,但可以抑制Dexa耐药株的生长。DHA联合Dexa作用于Dexa耐药株和敏感株后,其联合用药指数(combination index,CI)<1。DHA联合Dexa作用于病人原代CD138+细胞后,7.5 μMDexa和120 μMDHA联合用药对细胞的抑制作用强于各自单独用药。流式检测细胞凋亡及ROS结果显示,与DHA和Dexa各自单独用药相比,联合用药后细胞发生凋亡的细胞比例明显增加,且细胞产生的ROS显著增多。线粒体膜电位结果显示,DHA和Dexa联合用药后红色荧光细胞数减少,绿色荧光细胞数增多,结合流式结果分析,联合用药后线粒体膜电位显著降低。Western blot结果显示DHA和Dexa联合用药后位于细胞浆Cyt c显著升高,线粒体Cyt c显著降低;细胞cleaved Caspase-3在联合用药后表达量提高;Bcl-2在细胞给予一定剂量Dexa的第48、72和96 h表达量升高,在24 h随着Dexa浓度的升高,Bcl-2的表达量呈现下降趋势;Dexa联合DHA作用于细胞48 h后,无论Dexa在低浓度(3.75 μM)还是高浓度(60 μM)DHA都能回调Dexa所上调的Bcl-2。体内小鼠实验结果显示,注射MM.1S后小鼠肿瘤体积,在DHA和Dexa联合用药前后比较没有显著差异,联合用药后肿瘤质量变轻;注射MM.1R后小鼠肿瘤体积和肿瘤质量,在联合用药后均降低。结论:骨髓瘤体内外实验表明DHA在延长小鼠生存率、抑制MM细胞生长、促进MM细胞凋亡等现象上均强于ART。这种差异很可能是由ART和DHA对ROS引起线粒体凋亡的差异引起的。DHA对ROS水平、耗氧量水平和二价铁离子水平以及Caspase 3、Bcl-2和Bad的影响远大于ART。DHA联合Dexa后能克服Dexa耐药,且DHA和Dexa联合用药表现为协同增效作用,与单独用药相比可在体内外更显著抑制MM细胞的增长。DHA可增加Dexa产生的ROS水平、降低线粒体膜电位、引起更多的Cyt c(cytochrome C)外流以及抑制Bcl-2的上调,通过上述作用诱发更多的MM细胞凋亡。本课题研究结果为DHA可作为潜在的治疗MM的药物,为临床的用药提供理论依据。