【摘 要】
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Baeyer-Villiger单加氧酶（BVMOs）是一类应用广泛的生物催化剂,从催化酮类化合物发生亲核氧化到催化含杂原子的化合物发生亲电氧化,能够氧化硫醚合成亚砜类化合物。埃索美拉唑是目前治疗胃溃疡等疾病的亚砜类化合物,其药效好副作用低,由于其化学法合成存在反应条件苛刻、容易产物砜副产物和环境不友好等缺点,绿色环保的生物催化合成法逐渐成为研究热点,而获得高效高立体选择性的BVMOs是生物合成埃索
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Baeyer-Villiger单加氧酶（BVMOs）是一类应用广泛的生物催化剂,从催化酮类化合物发生亲核氧化到催化含杂原子的化合物发生亲电氧化,能够氧化硫醚合成亚砜类化合物。埃索美拉唑是目前治疗胃溃疡等疾病的亚砜类化合物,其药效好副作用低,由于其化学法合成存在反应条件苛刻、容易产物砜副产物和环境不友好等缺点,绿色环保的生物催化合成法逐渐成为研究热点,而获得高效高立体选择性的BVMOs是生物合成埃索美拉唑的关键。本文以来源于Thermobifida fusca的苯丙酮单加氧酶Tf PAMO基因为模板,在NCBI数据库中进行基因挖掘,获得来源于Limnobacter sp.的单加氧酶LnPAMO可以合成苯甲亚砜,并对其进行分子改造实现不对称合成埃索美拉唑的活性。具体研究内容如下:（1）生物信息学分析表明LnPAMO全长1608 bp,理论蛋白分子量大小60k Da,构建进化树及序列比对分析发现,其与来源于Thermobifida fusca的Tf PAMO序列相似性为50%,属于I型BVMOs。野生型酶LnPAMOWT对苯甲硫醚（MPS）具有较高活性,而对奥美拉唑硫醚（OPS）无催化活性。我们通过分子改造获得在2 m M OPS的底物浓度下转化率为41.83%的突变体LnPAMOMu3（Y495I/K329L/I246H）,产物是ee值＞99%的埃索美拉唑。分子动力学模拟结果表明,Y495I通过扩大底物通道入口来实现OPS进入催化腔,I246H为催化腔提供弱碱性环境有利于埃索美拉唑的稳定,K329L能够增强NADPH与LnPAMO的结合,提升供氢体NADPH的电子传递效率,提高LnPAMO不对称氧化OPS的活性。（2）为建立高效合成埃索美拉唑的全细胞催化体系,我们对LnPAMOMu3的大肠杆菌内表达及对OPS的全细胞催化反应条件进行优化。最优表达条件为:IPTG浓度0.2 m M,诱导温度25oC。最适反应条件为:助溶剂甲醇浓度1%,反应温度30oC,反应p H 8.0,细胞浓度40 mg/m L,葡萄糖浓度50 m M,NADP+浓度1 m M,反应时间8 h,无需添加额外的辅酶脱氢酶成分。通过优化条表达条件,在上述反应条件下,LnPAMOMu3细胞对2 m M OPS的转化率达到71.44%,并且产物埃索美拉唑的ee值＞99%。（3）对LnPAMO及其突变体进行酶学性质的表征,LnPAMOMu3氧化OPS最适反应温度为30oC,最适反应p H为8.0,在30oC下的半衰期为16.78 h,在p H 6.0-8.0范围内比较稳定。催化动力学参数测定结果显示,LnPAMOWT对MPS的Km值、kcat值和kcat/Km值分别为2.16 m M、2.01 min-1和0.93 min-1·m M-1,LnPAMOMu3对MPS的Km值、kcat值和kcat/Km值分别为0.40 m M、0.28 min-1和0.70 min-1·m M-1,对OPS的Km值、kcat值和kcat/Km值分别为0.24 m M、0.04 min-1和0.16 min-1·m M-1,比较表明LnPAMOMu3实现对大分子量的OPS氧化活性的同时,对MPS的亲合力也有提升,但对MPS催化活性下降,可能是Y495I突变促进底物结合,但催化腔空间结构的改变减弱酶对MPS的催化作用。同时,荧光结果显示,LnPAMOMu3对NADPH的氧化速率比LnPAMOWT提高49.43%,以活性最高的苯乙酮为底物时LnPAMOMu3对NADPH的氧化速率降低14.16%。相比于LnPAMOWT,LnPAMOMu3对苯丙酮、MPS和苯乙酮的氧化速率分别下降66.50%、61.98%和32.68%,说明虽然三点突变提高LnPAMO对NADPH的利用速率,但是也同时导致FADOOH对底物的氧化速率下降,所以对小分子量的底物酶活下降,从而改变了酶的底物谱。
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