骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,好发于青少年,恶性程度高,预后不佳,在0-14岁和0-19岁的人群中的发病率分别为4.0和5.0/百万人,这在青少年恶性发病率中排第8名。最近几年,术前应用新辅助化疗、手术及术后进行化疗的联合治疗方案为骨肉瘤的标准治疗方案,经过这样的系统治疗后,骨肉瘤未发生转移的患者5年生存率约为60%-70%,而有转移的患者5年生存率减少到30%。虽然化疗仍然是治疗骨肉瘤的首选,但是小分子药物糟糕的代谢动力学和全身系统毒性仍然是医生和患者担忧的主要问题。最近,很多研究集中在原位药物递送系统,例如温敏聚合物水凝胶(Gels)。化疗药物可以在低温(如4°C)轻易地分散到温敏聚合物溶液中,而不使用有机溶剂辅助,这个药物释放仓库可以在体温的刺激下在原位自动成型。局部注射可以轻松的通过一支注射器来操作,这样就能减少手术带来的创伤。对比于全身应用化疗药物,水凝胶的局部连续药物释放可以有效提高药物效力同时减少全身系统副作用。微球(MPs)介导的药物控制释放体系在很多疾病治疗中都有广泛应用。有很多聚合物可以用来制作不同性质的微球。在他们中,聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)作为生物可降解的合成聚合物之一受到广泛的关注,很多研究表明,以PLGA为材料制作的微球可以包载很多小分子药物,例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(CDDP)、地塞米松(DMS)、多西紫杉醇(DTX)、阿霉素(DOX)以及紫杉醇(PTX)。随着PLGA骨架的逐步降解,搭载小分子药物的微球可以稳定的包封和释放药物,可以实现的长期持续的给药。当今血管阻断作用的药物与细胞毒性药物的联合应用已经报道拥有更好的抗肿瘤效果,可以诱导肿瘤全区域的细胞凋亡,Combretastatin A-4(CA4)可以通过阻断内皮细胞微管蛋白来摧毁血管结构,通过阻断氧和其他重要营养物质的交换最终导致肿瘤的坏死。CA4在体外血管内皮细胞增殖阶段有重要作用,但是在细胞周期的静止期作用有限。由于CA4的抗肿瘤效果只表现在血管增殖旺盛的肿瘤组织内部,而没有对肿瘤细胞增殖的抑制作用,经常导致肿瘤治疗的失败以及远端的转移。幸运的是,肿瘤组织边缘的细胞具有丰富成熟的血管结构,对于传统的化疗药物较敏感,这启发了我们探索梯度释放CA4与细胞毒性药物的载药体系。然而通过静脉注射两种药物的协同化疗效果并不明显,这主要是由于药物在体内的循环半衰期很短,以及药物的非选择性药物分布导致的。此外,联合应用CA4和细胞毒性药物的释放顺序也非常关键,如果外周肿瘤细胞先被细胞毒性药物杀伤,实体肿瘤内部的肿瘤细胞会存活下来导致肿瘤的复发和转移。为了解决以上这些问题,提高骨肉瘤的治疗效果,降低化疗造成的全身系统毒副作用,本实验合成了理化性质优良的聚氨基酸温敏水凝胶,和可控粒径的PLGA微球,并从中选取了最适宜治疗骨肉瘤的微球,详细研究了凝胶和微球的性质;最终利用温敏水凝胶包裹微球作为药物缓释共载体,它具有梯度降解特性,先后释放CA4和DTX来治疗骨肉瘤。将载药复合材料局部注射入肿瘤旁皮下位置,CA4先释放,破坏新生血管,抑制新血管生成,阻断了肿瘤与周围组织的营养物质交换。随后释放的DTX通过药物分散渗透作用杀死表面肿瘤细胞,引起肿瘤的全区域坏死。具体研究方案包括以下两个部分:1)不同粒径的多西紫杉醇PLGA微球的制备及特性的研究本研究中以PLGA为材料用水包油包水溶剂挥发法制备了搭载DTX的PLGA微球,这种方法简单易行,包封效率高,能减少药物的损失,并运用控制剪切速度来控制微球的粒径,通过观察微球的电镜照片,说明控制剪切速度能够有效控制微球的粒径大小,得到的微球拥有完整光滑的表面和标准的球形。并通过不同粒径载药PLGA微球的降解和释放试验,确定了不同粒径微球的降解时间和释放药物的性质,有利于根据病情及不同疾病需要选取微球的降解时间和释放曲线与疾病治疗时间和药物最佳释放速度相一致适宜的微球。通过研究不同粒径的搭载DTX的微球的降解和释放过程,发现由于粒径2.94μm的载药微球具有较长且适宜的降解时间(49天),且释放性质良好,确定应用粒径2.94μm的载药DTX微球作为梯度降解的微球/水凝胶复合体系治疗骨肉瘤。2)可相继降解的搭载微球的温敏凝胶作为药物缓释载体在骨肉瘤治疗中的应用本研究使用的聚(L-丙氨酸-共-L-苯丙氨酸)-聚(乙二醇)-聚(L-丙氨酸-共-L-苯丙氨酸)(PLAF-b-PEG-b-PLAF)聚合物是通过NH2-PEG-NH2作为大分子引发剂将L-丙氨酸N-羧基-环内酸酐(L-Ala NCA)和L-苯丙氨酸N-羧基-环内酸酐(L-Phe NCA)开环聚合而成,运用物理混合的方法将载药PLGA微球和CA4混合入聚氨基酸凝胶中形成溶液,并对聚氨基酸凝胶,微球与复合材料进行了相关表征,该聚合物溶液在体温时可以由溶液转变为凝胶状态,注射入机体之后,可以在42天内缓慢的梯度释放DTX与CA4,并充分发挥这两种药物的协同作用,诱导骨肉瘤细胞凋亡。动物实验表明,将载药复合材料注射入肿瘤旁局部,形成凝胶后,复合材料的微球包裹在凝胶内部,随着凝胶的层层降解,微球逐步分散出来,由于聚氨基酸凝胶比PLGA微球降解速度快,而且聚氨基酸凝胶具有初始突释,因此在早期释放出较多CA4抑制肿瘤血管生成,减少肿瘤跟周围组织的物质交换,同时小分子药物DTX通过组织间隙进入肿瘤组织,从而杀死肿瘤细胞,载药复合材料(Gel/CA4-MP/DTX)组具有最佳的治疗效果。更重要的是,通过系统的组织学和免疫组化的研究,这种复合材料能够有效降低药物毒性,在很长时间内比游离纯药有更好的抗肿瘤增殖效果。综上所述,本实验合成的复合材料能够注射入肿瘤局部,且长时间维持肿瘤局部的药物高浓度,表现出良好的抗肿瘤治疗效果,减少化疗药物毒副作用,且材料本身无毒副作用,作为可注射型生物材料在局部药物协同化疗方面具有很高的应用价值。