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研究背景及目的肺癌是最常见的肿瘤,同时也是国内外癌症死因之首。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)能有效的延长部分肺癌患者的生存期。然而EGFR-T790M 突变、MET 扩增、HGF 分泌、HER2 扩增、IGF-1R 的活化、EMT、PTEN缺失等机制使患者对EGFR-TKIs产生耐药。因此,寻找有效的治疗方法对于肺癌患者尤其是EGFR-TKIs耐药的患者而言意义重大。靶向PD-1/PD-L1通路的免疫检查点治疗已在多种恶性肿瘤的治疗中取得重大突破,2017年NCCN指南推荐抗PD-1/PD-L1疗法用于高表达PD-L1的肺癌患者。既往研究报道EGFR-TKIs可降低EGFR突变肺癌细胞PD-L1的表达,然而肺癌患者发生EGFR-TKIs耐药后肿瘤PD-L1的表达情况却鲜有报道,EGFR-TKIs耐药患者能否从抗PD-L1疗法中获益也有待明确。本研究通过TCGA数据库明确EGFR-TKIs敏感及耐药肿瘤及肿瘤微环境的差异,通过体内外实验证明EGFR-TKIs耐药可上调肺癌PD-L1的表达,并探究内在调控机制,同时通过体内外实验评估了抗PD-L1疗法对EGFR-TKIs耐药肺癌的疗效,为EGFR-TKI耐药患者提供新的治疗方法。方法使用吉非替尼耐药MET扩增的肺癌细胞PC-9R、肝细胞生长因子HGF刺激后的肺癌细胞、转染EGFR-19Del和/或EGFR-T790M突变质粒的293FT细胞,分别建立MMET扩增、HGF和EGFR-T790M突变的EGFR-TKIs耐药细胞模型。用Western Blot、流式细胞技术和RT-qPCR等技术比较前述细胞PD-L1的表达,并探究调控机制。将前述模型与T细胞共培养并用LDH细胞毒性实验比较肿瘤的免疫逃逸能力。PD-L1基因敲除的肺癌细胞及其阴性对照建立皮下瘤模型并用T细胞治疗比较肿瘤的免疫逃逸能力。分析TCGA数据库中肺腺癌相关的数据,比较EGFR-TKIs敏感及耐药肺癌的肿瘤突变负荷、PD-L1等免疫抑制分子及的表达、肿瘤微环境中肿瘤浸润淋巴细胞、细胞毒活性的改变。结果体外实验结果表明前述三种机制均可上调肿瘤PD-L1的表达,PI3K/Akt、MAPK、NF-kappa B信号通路参与EGFR-T790M突变诱导的PD-L1的表达;PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路而非NF-kappa B信号通路参与HGF和MET扩增诱导的PD-L1的表达;体内外实验结果表明MET扩增、HGF、EGFR-T790M突变上调肿瘤细胞PD-L1的表达降低T淋巴细胞的杀伤效果,敲除PD-L1基因降低PD-L1表达或抗PD-L1单克隆抗体可恢复人T淋巴细胞的杀伤能力。TCGA数据库中肺腺癌相关的数据提示:较EGFR-TKIs敏感的肿瘤而言,EGFR-TKIs耐药肺癌的肿瘤突变负荷高,PD-L1、PD-1等免疫抑制分子的表达增加。结论(1)相比EGFR-TKIs敏感肺癌而言,EGFR-TKIs耐药肺癌肿瘤突变负荷更高,肿瘤免疫抑制作用更强。(2)MMET扩增通过P13K/Akt和MAPK信号通路上调肿瘤细胞PD-L1的表达促进非小细胞肺癌的免疫逃逸(3)HGF通过PI3K/Akt和MAPK信号通路诱导PD-L1的表达促进非小细胞肺癌免疫逃逸(4)EGFR-T790M 突变通过 PI3K/Akt、MAPK 和 NF-kappa B信号通路诱导PD-L1的表达促进肺癌的免疫逃逸(5)EGFR-TKIs耐药细胞及皮下瘤通过上调PD-L1降低T细胞的杀伤能力,抗PD-L1疗法可恢复T细胞的杀伤能力。