论文部分内容阅读
灵菌红素(Prodigiosin，PG)是灵菌红素色素家族(prodiginines)中的一种，它是由一些沙雷氏菌属、放线菌属、假单胞菌属、海洋类细菌等产生的三吡咯、次生代谢产物。PG是一种重要的天然红色素，在医药、化工、染料等行业具有较大的应用前景。本论文以前期筛选的PG高产菌株粘质沙雷氏菌(Serratia marcecens)JNB5-1为研究模型来探究该菌合成PG受温度调控的机制。主要内容和结果如下：1)利用双向电泳(2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术分离和鉴定S. marcecens JNB5-1在不同发酵温度(28℃和37℃)条件下的差异蛋白。结果共鉴定出16个显著差异的蛋白。其中，PG合成途径中的氧甲基转移酶(PigF)、氧化还原酶(PigN)及与其合成间接相关的蛋白(酶)的表达量在37℃条件下(与28℃条件下比较)都出现极显著的下降。热休克蛋白(Heat shock protein，Hsp60)和超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)等应急性蛋白在37℃条件下表达量上升。2)利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术进一步分析显著差异蛋白编码基因的转录水平。结果表明：氧甲基转移酶、氧化还原酶和转酮醇酶(Transketolase)等基因在37℃条件下的转录水平均低于28℃条件下的。RT-qPCR验证了2-DE的结果，二者之间存在极显著的正相关关系。3)构建启动子探测载体并测定氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicol Acetyltransferase，CAT)的酶活，研究了PG合成途径中关键差异酶PigF和PigN基因上游启动子受温度调控的情况。结果发现：携带PigF基因上游启动子(P-pigF)的重组大肠杆菌在28℃条件下CAT的比酶活是5.02U·mg-1；37℃条件下CAT的比酶活是2.39U·mg-1；而携带PigN基因上游启动子(P-pigN)的重组大肠杆菌CAT的比酶活均为0。因此，P-pigF具有启动子的活性，并且28℃条件下比37℃条件下的强度高2.1倍，以上结果说明：P-pigF受温度的调控；而P-pigN不具有启动子活性。4)通过克隆、表达和Ni-NTA纯化获得重组酶PigF，首次研究了其酶学性质。结果表明：PigF最适反应pH为7.0，在pH6-9之间比较稳定。最适反应温度为30℃，在28℃以下稳定性较好，37℃时酶活迅速下降。Mg2+对PigF具有明显的激活作用，大多数金属离子对其具有不同程度的抑制作用， EDTA对其也有抑制作用。以3,4-二羟基苯甲酸为底物，Km值为14.6mmol·L-1，Vmax值为0.58mmol·L-1·min-1。以上研究为粘质沙雷氏菌合成PG受温度影响的原因提供了线索；为进一步研究粘质沙雷氏菌PG合成代谢奠定了基础；也为构建高产PG菌株、提高菌株产PG的温度适应性提供了理论指导。