近年来,因动脉粥样硬化(Artherosclerosis,AS)引起的冠心病、高血压等心血管疾病已成为威胁军事飞行人员健康和导致停飞的重要原因,研究飞行人员动脉硬化的早期防治,对维护飞行人员身体健康,延长飞行年限,提高空军战斗力有重要意义。高脂血症是动脉粥样硬化性心血管疾病的独立危险因素,我们在多个航空兵部队调查发现,飞行人员高脂血症发病率呈增高趋势和年轻化趋势。循证医学证据表明,高脂血症引起的内皮功能障碍是动脉粥样硬化的始动因素。研究表明,重复正加速度暴露会引起机体的心肌能量代谢紊乱,血中儿茶酚胺水平升高,刺激体内的非特异性炎症反应,促使血小板活化,氧自由基生成增多,可能导致血管内皮细胞损伤,加速随年龄增长的动脉硬化进程。重复正加速度作用是否通过加重高脂血症引起的血管内皮功能障碍,加速动脉粥样硬化进程,提高军事飞行人员动脉粥样硬化性心血管疾病的患病率,尚不明确。本课题采用高脂血症动物模型研究重复高正加速度作用是否会加重高脂血症大鼠血管内皮功能损伤,促进炎症反应,加速动脉粥样硬化进程,为进一步研究高载荷飞行作业对飞行员心血管系统的影响提供实验依据。由于飞行职业的特殊性,飞行人员用药不仅要考虑药物治疗的有效性,更要考虑药物治疗的安全性,包括药物治疗对飞行安全的影响。目前有大量研究证明中药多部位、多靶点综合治疗高脂血症的有效性和安全性。银杏叶提取物是中药银杏叶中提取的天然有效成分,研究发现,银杏叶提取物能通过抗氧化应激,调节血管舒缩,降低白细胞对内皮细胞的粘附,拮抗血小板活化等多种途径保护血管内皮,且副作用小,不影响认知等飞行作业能力。但银杏叶提取物对重复高正加速度应激引起的机体心血管系统损伤是否有保护作用,尚无文献报道。本课题采用正加速度暴露和高脂血症复合作用动物模型研究银杏叶提取物对复合作用动物模型血管内皮的保护作用及机制,为进一步探索高脂血症飞行员早期血管保护措施提供实验依据。第一部分重复正加速度暴露对高脂血症大鼠血管内皮结构和功能的影响及机理研究目的:1研究重复正加速度暴露对高脂血症大鼠血管内皮依赖舒张功能的影响2研究重复正加速度暴露对高脂血症大鼠血管炎症反应的影响方法:雄性sd大鼠32只,体重180~200g,随机分为4组:正常对照组(con组),重复正加速度应激组(+gz组),高脂组(hl组)和重复正加速度应激高脂组(hl+gz组),每组8只。con组和+gz组大鼠每天喂饲普通饲料,hl组和hl+gz组大鼠每天喂饲高脂饲料。+gz组和hl+gz组大鼠隔天采用动物离心机进行+gz应激处理,con组和hl组大鼠只在离心机上固定5min,不做离心暴露。+gz暴露峰值设定为+10gz,增长率为1g/s,峰值持续30s,每天暴露3次(间隔1min),每周暴露3天,实验周期为8周。监测大鼠体重和血脂的变化,实验结束次日(禁食16h),大鼠麻醉后腹主动脉采血,分离血清和血浆,留取肝脏和胸主动脉,分别观察检测下列指标:(1)血脂代谢指标:tc、ldl-c、hdl-c、tg和ox-ldl;(2)组织形态学指标:肝脏组织he染色光镜观察肝脏组织结构,动脉组织透射电镜观察内皮超微结构;(3)血管内皮依赖舒张功能:离体血管环实验测定血管内皮依赖性舒张反应;(4)氧化应激指标:sod、gsh-px、t-aoc、gsh、mda和no;(5)炎症反应指标:il-1β、il-6、tnf-α、sicam-1和et-1;(6)血小板活化指标:txb2和6-keto-pgf1α;(7)westernblot法测定nox4、enos、lox-1、nf-κbp-p65、nf-κbp65和vap-1蛋白表达;(8)qrt-pcr法测定nox4、enos、lox-1和nf-κbp65mrna表达;(9)免疫组化法观察enos和nf-κbp65的表达。结果:1血脂代谢:与con组相比,+gz组大鼠血脂水平无显著差异,hl组和hl+gz组大鼠血清tc、ldl-c和ox-ldl水平显著升高(p<0.05。与hl组相比,hl+gz组大鼠血清ldl-c水平显著升高(p<0.05)。2组织形态学变化2.1肝脏组织he染色光镜观察,con组大鼠肝脏组织结构完整,肝细胞形态结构清晰,细胞索以中心静脉为中心排列整齐;+gz组肝细胞未见明显病理变化;hl组肝组织结构变形、破坏,肝索排列紊乱,肝细胞肿胀明显,细胞浆里可见圆形脂肪空泡;hl+gz组肝组织结构破坏,出现片状坏死,肝索排列紊乱,肝细胞肿胀明显,细胞浆里可见大量圆形脂肪空泡。2.2胸主动脉内皮透射电镜观察,con组内皮细胞排列连续、规则,基底膜完整,内皮细胞无隆起与剥脱,线粒体结构清晰;+gz组内皮细胞排列紊乱,少量内皮细胞脱落,线粒体肿胀;hl组内皮细胞隆起,核皱缩变形,线粒体水肿,有少量空泡变性,脂质沉积;hl+gz组内皮细胞脱落增多,有基底膜断裂,线粒体明显肿胀、嵴溶解,腔内可见脱落细胞碎片。3血管内皮依赖性舒张功能:ach对各组血管均有浓度依赖性舒张作用,与con相比,+gz组、hl组和hl+gz组血管最大舒张效应均显著降低(p<0.05);与hl组相比,hl+gz组血管最大舒张效应进一步降低(p<0.05)。snp对各组血管均有浓度依赖性舒张作用,各组血管对snp的舒张反应无显著差异。4氧化应激指标4.1大鼠血清氧化应激指标:与con组相比,+gz组和hl+gz组大鼠血清sod、gsh-px和gsh水平显著降低(p<0.05),mda水平显著升高(p<0.05),hl组大鼠血清gsh-px和gsh水平显著降低(p<0.05)。与hl组相比,hl+gz组大鼠血清sod和gsh-px水平进一步降低(p<0.05),mda水平进一步升高(p<0.05)。4.2大鼠血管组织氧化应激指标:与con组相比,+gz组、hl组和hl+gz组大鼠主动脉匀浆t-aoc水平显著降低(p<0.05),mda水平显著升高(p<0.05)。与hl组相比,hl+gz组大鼠主动脉匀浆t-aoc水平进一步降低(p<0.05),mda水平进一步升高(p<0.05),no水平有下降趋势,但无统计学差异。5炎症反应指标5.1大鼠血清炎症反应指标:与con组相比,+gz组、hl组和hl+gz组大鼠血清促炎症因子il-1β、il-6和tnf-α水平显著升高(p<0.05),hl组和hl+gz组大鼠血清粘附蛋白sicam-1水平显著升高(p<0.05)。与hl组相比,hl+gz组大鼠血清促炎症因子il-1β、il-6和tnf-α水平进一步升高(p<0.05)。5.2大鼠血管组织炎症反应指标:与con组相比,+gz组、hl组和hl+gz组大鼠动脉组织il-6和et-1水平显著升高(p<0.05)。与hl组相比,hl+gz组大鼠动脉组织il-6和et-1水平进一步升高(p<0.05)。6血小板活化指标:与con组相比,+gz组、hl组和hl+gz组大鼠血浆txb2水平显著上升(p<0.05),6-keto-pgf1α水平显著降低(p<0.05),txb2和6-keto-pgf1α比例失衡。与hl组相比,hl+gz组大鼠血浆txb2水平进一步上升(p<0.05),6-keto-pgf1α水平无显著差异,txb2和6-keto-pgf1α比例进一步失衡。7westernblot检测结果显示,与con组相比,+gz组、hl组和hl+gz组大鼠主动脉enos表达显著降低(p<0.05);+gz组、hl组和hl+gz组大鼠主动脉nox4和vap-1表达显著增高(p<0.05);hl组和hl+gz组大鼠主动脉lox-1表达显著增高(p<0.05)。hl+gz组大鼠主动脉p-p65/p65水平显著升高(p<0.05)。与hl组相比,hl+gz组大鼠主动脉enos表达显著降低;nox4、lox-1、vap-1和p-p65/p65水平均显著提高(p<0.05)。8qrt-pcr检测结果显示,与con组相比,hl+gz组大鼠主动脉enosmrna表达显著下调(p<0.05);+gz组、hl组和hl+gz组大鼠主动脉nox4、lox-1和nf-κbp65mrna表达显著上调(p<0.05)。与hl组相比,hl+gz组大鼠主动脉enosmrna表达显著降低(p<0.05);nox4、lox-1和nf-κbp65mrna水平显著增加。9免疫组化观察结果显示,enos在con组动脉内皮呈强阳性染色,+gz组和hl组动脉内皮呈弱阳性染色,hl+gz组动脉内皮呈微弱阳性染色。nf-κbp65在con组主动脉壁呈弱阳性染色,+gz组和hl组主动脉壁细胞核内阳性表达明显增加,hl+gz组主动脉壁呈强阳性染色,细胞核内阳性表达明显增加。结论:1重复高正加速度暴露能加重高脂血症大鼠的脂代谢紊乱和氧化应激损伤,加重血管的内皮依赖性舒张功能障碍,其机制可能与正加速度应激进一步上调nox4表达,提高内皮氧化应激水平,降低enos表达相关。2重复高正加速度暴露能促进高脂血症大鼠的炎症反应,加重血管内皮的炎症损伤,其机制可能与正加速度应激促进活化血小板,进一步上调lox-1表达,激活nf-κb,增加促炎症因子的产生相关。第二部分银杏叶提取物对重复正加速度暴露高脂血症大鼠血管内皮损伤的保护作用研究目的:1研究银杏叶提取物对重复正加速度暴露高脂血脂症大鼠血管内皮依赖舒张功能的保护作用2研究银杏叶提取物对重复正加速度暴露高脂血脂症大鼠血管炎症损伤的保护作用方法:雄性sd大鼠50只,体重180~200g,随机分为5组:正常对照组(con组),正加速度应激高脂组(hl+gz组),银杏叶提取物低剂量干预组(gbe-l组),银杏叶提取物中剂量干预组(gbe-m组)和银杏叶提取物高剂量干预组(gbe-h组),每组10只。con组大鼠每天喂饲普通饲料,hl+gz组、gbe-l组、gbe-m组和gbe-h组大鼠每天均喂饲大鼠高脂饲料,并且隔天采用动物离心机进行+gz应激处理,con组大鼠只在离心机上固定5min,不做离心暴露。+gz暴露峰值设定为+10gz,增长率为1g/s,峰值持续30s,每天暴露3次(间隔1min),每周暴露3天,实验周期为8周。药物干预采用预防性给药,gbe-l组、gbe-m组和gbe-h组大鼠每天上午8时左右(离心机暴露前)灌胃给药1次,连续给药8周,给药体积为10ml/kg,灌胃前称取体重以确定灌药量,gbe低、中、高剂量组大鼠每天分别按50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg给予gbe混悬液,con组和hl+gz组给予等量溶剂。实验结束次日(禁食16h),大鼠麻醉后腹主动脉采血,分离血清和血浆,留取肝脏和胸主动脉,观察检测指标同第一部分。结果:1血脂代谢:与hl+gz组相比,gbe-l组、gbe-m组和gbe-h组大鼠血清tc和ldl-c水平显著降低(p<0.05),gbe-m组和gbe-h组大鼠血清ox-ldl水平显著降低(p<0.05)。与gbe-l组相比,gbe-m组和gbe-h组大鼠血清tc、ldl-c和ox-ldl水平进一步降低(p<0.05)。2组织形态学变化2.1肝脏组织he染色光镜观察,con组大鼠肝脏组织结构完整,肝细胞形态结构清晰,细胞索排列整齐;hl+gz组肝组织结构破坏,出现少量片状坏死,肝索排列紊乱,肝细胞肿胀明显,细胞浆里可见大量圆形脂肪空泡;与hl+gz组相比,gbe-l组、gbe-m组和gbe-h组肝组织结构破坏减轻,肝细胞肿胀减小,细胞浆里脂肪空泡减少。2.2胸主动脉内皮透射电镜观察,con组内皮细胞排列连续、规则,基底膜完整,内皮细胞无隆起与剥脱,线粒体结构清晰;hl+gz组内皮细胞脱落增多,有基底膜断裂,线粒体明显肿胀、嵴溶解,腔内可见脱落细胞碎片;gbe-l组内皮细胞排列紊乱,有内皮细胞脱落,部分线粒体嵴溶解;gbe-m组和gbe-h组有内皮细胞隆起,少量内皮细胞脱落,少量线粒体肿胀、嵴溶解。3血管内皮依赖性舒张功能:ach对各组血管均有浓度依赖性舒张作用,与hl+gz组相比,gbe-m组和gbe-h组血管最大舒张效应显著升高(p<0.05),gbe-l组无显著差异。snp对各组血管均有浓度依赖性舒张作用,各组血管对snp的舒张反应无显著差异。4氧化应激指标4.1大鼠血清氧化应激指标:与hl+gz组相比,gbe-l组大鼠血清gsh-px和gsh水平显著升高(p<0.05);gbe-m组和gbe-h组大鼠血清sod、gsh-px和gsh水平显著升高(p<0.05),mda水平显著降低(p<0.05)。与gbe-l组相比,gbe-m组和gbe-h组大鼠血清sod、gsh-px和gsh水平显著升高(p<0.05),mda水平显著降低(p<0.05)。4.2大鼠血管组织氧化应激指标:与hl+gz组相比,gbe-m组和gbe-h组大鼠主动脉t-aoc水平显著升高(p<0.05),mda水平显著降低(p<0.05);no水平均无显著差异。与gbe-l组相比,gbe-h组大鼠主动脉浆t-aoc水平显著升高(p<0.05),mda和no水平无显著差异。5炎症反应指标5.1大鼠血清炎症反应指标:与hl+gz组相比,gbe-l组、gbe-m组和gbe-h组大鼠血清il-6、tnf-α和sicam-1水平显著下降(p<0.05),gbe-m组和gbe-h组大鼠血清il-1β水平显著下降(p<0.05)。与gbe-l组相比,gbe-m组和gbe-h组大鼠血清il-1β、tnf-α和sicam-1水平进一步下降(p<0.05),gbe-h组大鼠血清il-6水平进一步下降(p<0.05)。与gbe-m组相比,gbe-h组大鼠血清tnf-α水平进一步下降(p<0.05)。5.2大鼠血管组织炎症反应指标:与hl+gz组相比,gbe-l组、gbe-m组和gbe-h组大鼠动脉组织il-6水平显著下降(p<0.05),gbe-m组和gbe-h组大鼠血清et-1水平显著下降(p<0.05)。与gbe-l组相比,gbe-m组和gbe-h组大鼠动脉组织il-6和et-1水平显著降低(p<0.05)。6血小板活化指标:与hl+gz组相比,gbe-l组、gbe-m组和gbe-h组大鼠血浆txb2水平显著上升(p<0.05),6-keto-pgf1α水平显著下降(p<0.05)。与gbe-l组相比,gbe-h组大鼠血浆6-keto-pgf1α水平显著上升(p<0.05)。gbe药物干预能减轻txb2和6-keto-pgf1α比例失衡。7westernblot检测结果显示,与hl+gz组相比,gbe-l组、gbe-m组和gbe-h组大鼠主动脉enos表达显著升高(p<0.05),lox-1表达显著降低(p<0.05);gbe-m组和gbe-h组大鼠主动脉nox4、vap-1和nf-κbp-p65/p65水平显著降低(p<0.05)。与gbe-l组相比,gbe-m组和gbe-h组大鼠主动脉nox4、vap-1和nf-κbp-p65/p65水平显著降低(p<0.05)。8qrt-pcr检测结果显示,与hl+gz组相比,gbe-m组和gbe-h组大鼠主动脉nox4mrna表达显著下调(p<0.05),enosmrna表达显著上调(p<0.05),gbe-l组、gbe-m组和gbe-h组大鼠主动脉lox-1、nf-κbp65mrna表达显著下调(p<0.05)。与gbe-l组相比,gbe-m组和gbe-h组大鼠主动脉nox4、lox-1和nf-κbp65mrna表达显著下调(p<0.05),enosmrna表达显著上调(p<0.05)。9免疫组化观察结果显示,enos在con组动脉内皮呈强阳性染色,hl+gz组动脉内皮呈微弱阳性染色,gbe干预组动脉内皮呈弱阳性染色。nf-κbp65在con组主动脉壁阳性表达较少,hl+gz组主动脉壁阳性表达明显增加,且细胞核内阳性表达明显增加,gbe干预组主动脉壁阳性表达有减少趋势。结论1gbe干预能剂量依赖性减轻重复正加速暴露高脂血症大鼠的脂代谢紊乱和氧化应激损伤,减轻血管的内皮依赖性舒张功能障碍,其机制可能与下调nox4表达,降低氧化应激水平,提高enos的表达相关。2gbe干预能剂量依赖性降低重复正加速暴露高脂血症大鼠的炎症反应,减轻血管内皮的炎症损伤,其机制可能与降低ox-ldl水平和拮抗血小板活化,下调lox-1表达,抑制nf-κb活化,减少促炎症因子的产生相关。第三部分基于代谢组学的银杏叶提取物对急性正加速度暴露大鼠应激损伤的保护作用机制研究目的:1研究正加速度暴露对大鼠血清代谢谱的影响;2研究银杏叶提取物对正加速度暴露大鼠血清代谢谱的保护作用;方法:雄性sd大鼠60只,体重180~220g,大鼠随机分为5组:对照组(cg),正加速度应激模型组(mg),银杏叶提取物低剂量干预组(ldg),银杏叶提取物中剂量干预组(mdg)和银杏叶提取物高剂量干预组(hdg),每组12只。对照组和模型组从第1天到第14天口服给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液,给药体积10ml/kg。低、中、高剂量干预组从第1天到第14天灌胃给予gbe,给药剂量分别为50mg/kg,100mg/kg和200mg/kg,所有药物均混悬于0.5%羧甲基纤维素钠溶液。在第14天给药后,模型组和低、中、高剂量组大鼠采用动物离心机进行+gz应激处理,对照组大鼠在有机玻璃盒中固定,不做离心机暴露。+gz暴露峰值设定为+10gz,增长率为1g/s,峰值持续5min,暴露1次。正加速度暴露实验后,眼眶静脉丛取血用于代谢组学分析;大鼠麻醉后腹主动脉采血,用于测定血液生化指标。采用基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(uhplc-q-tofms)的代谢组学方法分析正加速度暴露对大鼠血清代谢轮廓的扰动和gbe的保护作用。采用主成分分析(pca)和偏最小二乘判别分析(pls-da)等多元统计分析方法筛选正加速度暴露相关潜在的生物标志物。通过与标准品进行保留时间和一级质谱、二级质谱的对比,鉴别代谢标志物的结构。结果:1血清生化指标:与对照组相比,模型组t-aoc、t-sod、gr和gpx活性显著降低(p<0.05),mda水平显著升高(p<0.05)。与模型组相比,在中、高剂量药物干预组T-AOC、T-SOD、GR和GPx活性显著升高(P<0.05),MDA水平显著降低(P<0.05),低剂量药物干预组无显著差异。2血清代谢轮廓分析:模型组的代谢谱偏离正常组,中、剂量银杏叶提取物干预组偏离模型组,接近对照组,说明中、高剂量的银杏叶提取物对+Gz诱导的代谢紊乱有改善作用,高剂量效果更优。3正加速度暴露相关潜在生物标志物:多元统计分析发现18个差异代谢物。与对照组相比,脂肪酸β氧化通路相关棕榈酸、油酸水平升高,Linoleyl肉碱和Vaccenyl肉碱水平降低;甘油磷脂代谢通路相关溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰胆碱,包括(LysoPE(0:0/18:2))、LysoPC(14:0)、LysoPC(15:0)、LysoPC(18:1)、LysoPC(17:0)、LysoPC(20:2)和LysoPC(20:1)水平降低;鞘类磷脂代谢相关鞘氨醇-1-磷酸和二氢鞘氨醇-1-磷酸的水平升高;胆汁酸代谢相关牛磺胆酸和牛磺熊去氧酸水平升高;嘌呤代谢相关尿囊素和尿酸的水平升高;赖氨酸代谢通路相关赖氨酸的水平降低。4 GBE对正加速暴露相关生物标志物的影响:高剂量GBE干预能显著调节11个生物标志物的代谢水平,包括脂肪酸β氧化通路中的Linoleyl肉碱、Vaccenyl肉碱、棕榈酸和油酸,参与嘌呤代谢代谢的尿酸和尿囊素,参与赖氨酸代谢的赖氨酸,参与甘油磷脂代谢的Lyso PC(14:0)、LysoPC(15:0)、LysoPC(18:1)和LysoPC(17:0)。结论:1正加速度暴露可导致大鼠血清代谢谱偏离正常代谢谱,显著影响脂肪酸β氧化通路、甘油磷脂代谢、鞘类磷脂代谢,胆汁酸代谢,嘌呤代谢和赖氨酸代谢;2银杏叶提取物可使正加速度诱导偏离的代谢谱向正常代谢谱靠近,改善高正加速度暴露引起的脂肪酸β氧化通路、甘油磷脂代谢、嘌呤代谢和赖氨酸代谢紊乱,减轻高正加速度暴露导致的应激损伤。