本研究选取了两种代表类型的食线虫真菌刀孢轮枝菌(Lecanicilliumpsalliotae)和粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)，根据文献报道的几丁质酶编码基因序列设计了一对简并引物，应用PCR和DNA Walking技术从刀孢轮枝菌(L.psalliotae)和粉红螺旋聚孢霉(C.rosea)中分别克隆得到了与侵染相关的几丁质酶的编码全长基因序列Lpchi1和Crchi1。为了进一步研究几丁质酶的功能，对两种几丁质酶基因分别进行了异源表达，并对重组几丁质酶的生理生化性质、几丁质酶对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)卵的作用以及几丁质酶的晶体结构进行了解析。研究结果不仅对食线虫真菌产生的胞外侵染性几丁质酶的研究具有重要的理论意义，对于高效线虫生防制剂的开发也具有潜在的应用价值，对研究昆虫生防制剂和真菌生防制剂提供了很好的研究基础和模型，也为人体病原真菌中以几丁质酶为作用靶点的抑制剂研究提供了研究模型。 主要研究结果为： (一)刀孢轮枝菌(L.psalliotae)侵染性几丁质酶的基因克隆、表达、纯化和对南方根结线虫(M.incognita)卵的侵染作用1.从刀孢轮枝菌(L.psalliotae，YMF1.00112)中克隆得到与侵染线虫相关的胞外几丁质酶编码基因，并递交GenBank，序列索引号为EF203917。 扩增得到的几丁质酶编码基因Lpchi1全长为1425 bp，包含三个内含子(长度分别为49 bp，51 bp，53 bp)。该基因编码的多肽链包含423个氨基酸残基。去除信号肽后，几丁质酶理论的分子量和等电点分别为42.4 kDa和5.56，预测的几丁质酶有两个糖基化位点(NRS和NPS)。 2.不同真菌来源的胞外几丁质酶的同源性和系统发育分析。 通过对GenBank上报道的捕食线虫真菌、昆虫病原真菌和重寄生真菌的胞外几丁质酶的氨基酸序列进行同源性比较，发现这些不同真菌来源的几丁质酶具有较高的同源性。从系统进化分析可以看出这些来源于不同真菌的几丁质酶根据分子量的大小形成明显的进化分枝。在糖基水解酶超家族的18家族中，来源于病毒和细菌的几丁质酶聚类于同一亚枝。真菌来源的几丁质酶当中，来源于人的致病真菌的几丁质酶聚类于同一亚枝。来源于重寄生真菌的几丁质酶聚类在一起。而刀孢轮枝菌产生的几丁质酶LPCHI1与昆虫病原真菌聚在了一起。 3．Lpchi1在毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)中的表达及纯化。 通过RT-PCR及酶切、连接，成功构建了pPIC9K/Lpchi1的表达载体，电转毕赤酵母P.pastoris GS115后，经过G418平板筛选，筛选得到高表达活性的转化子。表达产物的SDS-PAGE分析表明pPIC9K/Lpchi1的发酵液上清中可检测到一条对照菌株中所没有的条带，分子量为44 kDa左右。转化子的发酵液上清经30％酒精分级沉淀后，通过分子筛(HiLoad 26/60 Superdex 75 prep grade)纯化得带目的蛋白。 4．几丁质酶LPCHI1对南方根结线虫(M.incognita)卵的侵染作用。 纯化的几丁质酶LPCHI1和蛋白酶Ver112分别或混合与南方根结线虫(M.incognita)卵共孵化3天后，大多不成熟的线虫卵不能继续发育。显微镜观察发现经几丁质酶LPCHI1处理后，根结线虫(M.incognita)卵的卵壳结构发生了显著变化，有些卵出现了大的空泡，而有些卵的卵壳不同程度的被降解或变形，它们将不能继续发育。几丁质酶LPCHI1和蛋白酶Ver112对线虫卵的侵染起协同作用。 (二)粉红螺旋聚孢霉(C. rosea)侵染性几丁质酶的基因克隆、表达、纯化和晶体结构分析1．从粉红螺旋聚孢霉(C rosea，YMF1.00611)中克隆得到与侵染线虫相关的胞外几丁质酶编码基因，并递交GenBank，序列索引号为EU000575。 粉红螺旋聚孢霉(C.rosea)胞外几丁质酶的编码基因Crchi1包含三个内含子(长度分别为64 bp，58 bp，62 bp)。该基因编码的多肽链包含426个氨基酸残基。去除信号肽后，几丁质酶理论的分子量和等电点分别为43.8 kDa，预测的几丁质酶有两个糖基化位点(NRS和NPS)。 2．Crchi1在E coli BL21中的表达和纯化。 通过RT-PCR及酶切、连接，成功构建pET28a/Crchi1表达载体，并在E.coliBL21中成功表达。通过表达产物的SDS-PAGE分析，pET28a/Crchi1的细胞破碎物上清中可检测到一条对照菌株中所没有的条带，分子量为44 kDa左右。通过Ni-NT介质金属螯合亲和柱和阴离子HiTrapTM Q FF交换层析纯化后得到目的蛋白。 3．采用Hampton Research公司的(Crystal Screening Kit I)得到该几丁质酶的晶体，对其进行X-射线衍射，得到1.8°A的数据收集结果。 将纯化后得到目的蛋白CrChi1浓缩至20mg/ml，用蛋白结晶试剂盒HamptonResearch公司的HR2-126进行条件筛选，并对生长条件：NH4H2PO4和PEG3350进行梯度优化，一周后均长出不同形态的晶体。挑取形态不同的晶体，对其进行X-射线衍射，收集数据结果。使用HKL2000，O，ccp4等软件进行处理，获得该几丁质酶的三维结构。 4．浸泡得到caffeine-CrChi1抑制剂复合物晶体，X-射线衍射，得到1.6°A的数据收集结果。 配制不同浓度抑制剂caffeine(0.1 mM、0.2 mM、0.5 mM、1 mM、2 mM、3 mM、5 mM)，分别加入1 ul于晶体中。将晶体生长板作好标记，放置于16℃的晶体生长室中进行晶体生长，晶体过夜培养后，进行X．射线衍射，收集数据结果。使用HKL2000，O，ccp4等软件进行处理，获得该几丁质酶抑制剂复合物的三维结构。 论文的创新性主要体现为： 1)首次从食线虫真菌刀孢轮枝菌(L.psalliotae)、粉红螺旋聚孢霉(C.rosea)中分别克隆得到了与侵染相关的几丁质酶的编码全长基因(Lpchi1和Crchi1)，并分别在毕赤酵母(P.pastoris GS115)中和E coli BL21中成功表达。 2)首次报道食线虫真菌粉红螺旋聚孢霉(C.rosea)产生的与侵染线虫相关的几丁质酶的晶体结构以及几丁质酶抑制剂复合物(caffeine-CrChi1)的晶体结构。