肝部分切除术（Partial Hepatectomy, PH）是目前治疗各种肝脏良恶性疾病最有效方法之一。但扩大性肝切除术后易出现致命性肝功能衰竭，其治疗仍是世界性难题。虽然肝移植是有效治疗途径，但供体严重不足限制其广泛开展；现有生物人工肝技术仍不能完全替代肝脏功能；肝细胞移植体内后增殖有限，也限制其治疗效果。肝脏与其它器官不同，具有巨大的潜在再生能力，肝切除术后残肝主要通过成熟的肝细胞复制增殖实现再生。但目前对其自身调控机制研究极少，仅有少量文献报告TGF-β表现为负向调控肝细胞增殖。因此，探索肝细胞再生分子机制具有极其重要的现实意义，从而为临床促进肝再生、防治肝功能衰竭奠定理论基础。我们前期国家自然科学基金课题研究显示，Tmub1蛋白在肝细胞增殖周期中对其增殖进程发挥了重要的自身调控作用。Tmub1于2005年首次报道，包含245个氨基酸，其结构主要有1个类似泛素结构的区域（UBL；121-175aa），包含了与UCH、E2和CUE的反应位点。目前对Tmub1基因及其蛋白研究结果：Tmub1蛋白为一种穿梭蛋白。过表达Tmub1可显著抑制大鼠H-35肝癌细胞增殖；Tmub1沉默后导致异常中心体、多核细胞出现以及异常纺锤体形成。这些研究结果均表明Tmub1基因及其蛋白产物在肝再生细胞增殖周期中发挥了重要的调控作用，但其具体的机制还不十分明确。目前体外肝细胞基因转染已有许多报道，技术趋于成熟，而体内肝脏基因转染方法不一，有通过小鼠尾静脉注射的，但常需注射大量的病毒质粒，超过小鼠生理负荷量，甚至致死，而且转染效率低；较普遍通过大鼠门静脉注射法，可以减少病毒注射量，转染效率明显好于尾静脉注射，但门静脉位置深，易出血致实验失败，而且通过门静脉注射引起入肝血流量的变化，肝窦压力改变，可导致肝窦状细胞分泌多种细胞因子，改变了肝脏原有内环境，导致潜在实验性干扰。如何优化体内肝脏基因转染途径以进一步完善肝脏的研究方法及其临床运用，这些问题还未见报道。目的：1、探讨肝脏基因转染大鼠体内动物实验模型，通过对比探讨一种既操作方便、对大鼠刺激反应较小，又具有较高基因转染率的大鼠肝内基因转染方法。2、通过沉默Tmub1基因，观察大鼠肝切除术后肝细胞增殖周期进程的变化及Tmub1蛋白对肝再生的影响。3、初步探讨Tmub1蛋白对肝细胞增殖周期调控机制，分析可能相关的调控蛋白及作用机制。研究内容及方法：1.大鼠肝脏Tmub1RNAi慢病毒体内转染及效果检测的实验研究1.1大鼠动物实验及分组。大鼠的盲肠静脉粗大，位置表浅，易于寻找，操作简单，周围有丰富的脂肪组织，并且盲肠静脉属于门静脉的属支，因此，将大鼠分为盲肠静脉组、门静脉组、尾静脉组及对照组，分别注射携带绿色荧光蛋白（GFP）重组Tmub1RNAi慢病毒。1.2在肝内基因转染后第二天行肝脏组织冰冻切片，运用激光共聚焦显微镜观察各组GFP表达情况，比较各组转染率。1.3评估经门静脉和盲肠静脉注射对门静脉压力的影响。设盲肠静脉和门静脉注射组各3只大鼠，用PowerLab/8sp数据采集系统（ADinstruments, AU）检测在注射时门静脉压力的变化情况，以此比较两者注射方式对门静脉压力的影响。1.4检测三种注射方法对大鼠肝功及机体刺激反应的影响。在注射后第二天同时取5ml非抗凝门静脉血，ELISA试剂盒（eBioscience, San Diego, CA）检测每份标本的谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase,AST）、肿瘤坏死因子-（aTumor Necrosis Factor-a, TNF-a）和白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）的值，每份标本至少检测3次，进行统计分析。2、研究Tmub1沉默对肝切除术后肝再生细胞增殖周期影响2.1大鼠动物实验及分组。在体内肝脏成功转染后，复制经典的70%大鼠肝切除术动物模型，于PH术后第2天提取原代肝细胞及肝组织作为标本，研究Tmub1沉默对肝切除术后肝再生细胞增殖周期影响。将36只大鼠随机分三组，即Tmub1RNAi实验组，慢病毒空载体组，对照组，每组均分别取PH术后0h、2h、12h、24h共4个时相点各3只大鼠。2.2运用RT-PCR法及Western Blot法分别检测提取的肝细胞样本中的Tmub1基因及securin基因的mRNA水平和蛋白表达情况，其中对Tmub1的检测反映RNAi慢病毒干扰效果及Tmub1沉默效果，对securin的检测反映Tmub1沉默后对其基因水平及蛋白水平的影响。2.3用噻唑蓝（MTT）实验检测各组肝细胞增殖情况。将各组肝部分切除术后提取的细胞收集到含血清的培养基中，将细胞稀释至25×103个/ml，加入MTT试剂温育3h，用酶标仪检测OD值，绘制曲线图。2.4流式细胞仪观察各实验组细胞周期情况。将各实验组提取细胞的细胞固定，半个小时左右行流式细胞仪检测，及时分析数据结果。2.5Immunoprecipitation法及蛋白质谱分析检测Tmub1蛋白与securin相互作用。在收获的细胞中加入适量细胞IP裂解缓冲液提取蛋白，将10-50μl securin抗体加入到细胞裂解液进行免疫沉淀，并行Western blotting电泳分析及蛋白质谱分析。结果：1.大鼠肝脏Tmub1RNAi慢病毒体内转染及效果检测的实验研究1.1大鼠体内肝脏慢病毒注射操作情况。统计三组平均注射操作时间，经门静脉注射最复杂、耗时，尾静脉注射最方便，而经盲肠静脉平均注射时间约8-17分钟。三组实验操作成功率方面，经盲肠静脉及尾静脉注射全部成功，而经门静脉注射组有3只大鼠死亡，其死亡原因均为腹腔内出血，盲肠静脉周围有丰富的脂肪组织，注射后压迫10秒后即可止血。1.2激光共聚焦显微镜观察肝脏冰冻切片的GFP表达情况，盲肠静脉组与门静脉组均可明显观察到较强绿色荧光，两组转染效果基本一致，并且绿色荧光表达在肝细胞索上，尾静脉注射组仅观察到散在荧光，转染率较低，在对照组的大鼠肝脏切片中均未见绿色荧光。1.3测压实验中，门静脉注射明显增加门静脉压力，而经盲肠静脉注射对门静脉的影响较小，在注射操作时仅引起瞬间波动，但很快就能恢复至正常水平。1.4血清肝转氨酶、IL-6和TNF-a的ELISA结果。盲肠静脉组血清转氨酶（ALT182.0±29.9IU/L,AST114.4±17.5IU/L）及IL-6和TNF-a值（IL-6244.5±48.4pg/ml,TNF-a137.4±81.8pg/ml）明显低于门静脉组和尾静脉组，差异具有统计学意义（n=20，P <0.001），盲肠静脉注射方式明显减轻对肝功及机体的应急刺激反应的影响。2.研究Tmub1沉默对肝切除术后肝再生细胞增殖周期影响2.1. Tmub1RNAi干扰效果检测，实验组Tmub1mRNA和蛋白表达均被有效抑制（p<0.05），结果与激光共聚焦结果基本一致。2.2MTT实验显示，Tmub1RNAi实验组明显上调PH术后6h-24h肝细胞的增殖速率。同时流式细胞术检测发现，Tmub1沉默组肝细胞增殖的G₂/M期占11.07%,高于对照组2.68%，两组细胞比例数具有明显差别。Tmub1沉默后，PH术后肝细胞增殖加速，主要集中在G₂/M期细胞。说明Tmub1蛋白下调了G₂/M期肝细胞的增殖速率。2.3RT-PCR及Western Blot结果发现，Tmub1沉默后，对securin mRNA无影响，但实验组G₂/M期细胞中securin蛋白表达明显下调。这说明Tmub1对securin在基因转录水平无明显影响，而主要作用于蛋白水平，进一步证明了Tmub1蛋白与securin降解间存在某种关系。2.4IP实验结果提示Tmub1蛋白和securin能在肝细胞中发生结合，同时，进一步进行蛋白质谱分析明确Tmub1蛋白和securin能在肝细胞中发生结合，并且两蛋白间产生了相互作用。结论：1、通过大鼠的盲肠静脉注射行肝内基因转染，这种方式对实验动物的应激刺激小，操作相对简单，并且可获得较好的转染效果，是一种便捷、安全的肝内基因转染途径。2、重组慢病毒载体可携带目前基因干扰片片段和GFP探针用于动物体内实验，并且能较好发挥较好的基因干扰效果。3、Tmub1沉默后导致肝细胞G₂/M期增殖速率明显加快，Tmub1蛋白能影响肝再生细胞增殖进程，在肝再生过程中起到重要的自身调控作用。4. Tmub1沉默后，对securin在基因转录水平无明显影响，而主要作用于蛋白水平，Tmub1蛋白以某种方式影响了securin在肝增殖细胞G₂/M期的蛋白量。5.在肝细胞内Tmub1蛋白和securin能发生结合，并且两蛋白间产生了相互作用，Tmub1在G₂/M期可能抑制肝细胞中securin的降解进程。