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β-1,3-1,4-葡聚糖酶能够有效地降解植物和微生物细胞壁来源的β-葡聚糖,通过添加外源β-葡聚糖酶可有效解决啤酒酿造中麦汁过滤困难,啤酒的非生物稳定性降低等问题,在饲料工业中也可提高禽畜对麦类饲料养分的吸收效率。如何获得高产β-葡聚糖酶的菌株已经成为目前研究的热点之一。本文主要以一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)为出发菌,构建了一株高效表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶的大肠杆菌(Escherichiacoli)重组菌,并对重组酶的分离纯化和酶学性质进行了研究。
通过PCR手段将本研究室保藏的一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌的bgl基因(GenBank数据库编号EU623974)扩增,克隆至三种不同性质的表达质粒载体oEGX-4T-1、pET20b(+)和pET28a(+)中,构建了重组质粒pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl。将pEGX-4T-1-bgl转化三种不同的大肠杆菌宿主;pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl分别转化E.coliBL21(DE3),采用IPTG在30℃下诱导表达重组蛋白,比较pEGX-4T-1的GST融合表达、pET20b(+)的PelB信号肽指导的分泌型表达和常用的带有强启动子和lac操作子的pET28aa[+)的组氨酸标签和T7标签的融合表达的效果。经SDS-PAGE分析和酶活测定表明,五种重组菌均表达出了重组蛋白,其中重组菌E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl具有最高的表达酶活,总酶活可达322.0±8.8U/mL,明显高于其他四种重组菌,为出发菌在最适摇瓶条件下所产酶活的40.1%,可以作为今后定向改造的适宜菌株。
为了考察E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl所产重组酶的实用价值,本文比较了制备粗酶液时各种破壁方法对重组酶活力的影响,结果表明冻融法效果较好。粗酶液经乙醇分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析分离纯化,经SDS-PAGE验证,得到了较纯的重组酶,纯化倍数为19.85倍,回收率为20.60%,比活力为13,437U/mg,分子量为30kDa左右。
对纯化后的重组酶的酶学性质研究表明,重组酶最适pH值为6.0,在pH4.5-6.0范围内较为稳定;最适温度为50℃,40-50℃范围内较稳定,10mmol/L的Cu2+和Fe2+对酶活有显著的抑制作用,与野生酶性质大致相同,表明该酶在啤酒酿造工业有一定的实用价值。