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热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是细胞在高温及其他应激条件下产生的一类高度保守的蛋白质，HSPs作为一类重要的分子伴侣，从原核细胞到真核细胞都有表达，在蛋白质折叠、转运、复性、降解中起重要作用。HSP90和HSP70是HSP家族最重要的成员，在各种应激反应中发挥着重要的作用，都具有抗细胞凋亡、细胞免疫等功能。启动子是位于基因5端的DNA序列，能被RNA聚合酶识别并结合，启动子作为调控基因表达的重要顺式元件，决定着基因的活动，因此启动子也日益成为研究的热点。本研究是在课题组已有的杂色鲍HdHSP90的cDNA基因全长及NCBI已公布的杂色鲍HdHSP70和HdHSC70基因cDNA序列的基础上，通过Genome walker、Tail-PCR以及常规PCR等技术克隆获得了这三个基因的5调控区序列。并结合重组质粒的构建、细胞培养、瞬时转染和双荧光素酶报告基因检测等方法，在转录调控水平揭示杂色鲍HdHSP90、HdHSP70和HdHSC70基因转录调控机制。主要研究结果如下: 1)通过Genome walker和Tail-PCR技术，利用已知的序列分别新扩增得到5调控区:杂色鲍HdHSP90基因2800bp、HdHSC70基因2013bp、HdHSP70基因2140bp。 2)生物信息学分析表明，这三个HSPs基因在转录起始位点(A)上游-30—-32bp之间都存在一个TATA box，且在不同的位置都有一个CpG岛，三者有很多共同的转录因子结合位点，如:ATF、NF-1、TBP、Sp1、Oct-1、C/EBPalp等，并都有多个热休克元件(HSE)。 3)通过验证确定杂色鲍HdHSP90基因的核心启动子区位于-98bp—+83bp之间，HdHSC70基因核心启动子区位于-104bp—+43bp之间，HdHSP70基因的核心启动子区位于-189bp—+46bp之间。 4)成功构建了杂色鲍HSP90基因7个不同长度缺失片段的启动子质粒，活性分析表明:7个缺失片段的启动子活性都比较高，其中pGL-90-6r活性最高。通过转录因子结合位点的突变分析得知在-624bp—-539bp间的Oct-1、C/EBPalpha、NF-1这三个转录因子都起到一定的抑制作用。 5)成功构建了杂色鲍HSC70基因7个不同长度缺失片段的启动子质粒，活性分析表明:不同长度缺失片段的HdHSC70基因启动子活性除了pGL-c70-7r出现明显的降低，且比pGL-c70-6r的活性有极显著降低(P＜0.01)外，其余活性都很高。通过突变分析最短的两个缺失片段之间的转录因子结合位点，结果发现杂色鲍HSC70基因靠近-252bp这一位置的ICSBP对杂色鲍HSC70基因的表达有一定的增强作用。 6)成功构建了杂色鲍HdHSP70基因7个不同长度缺失片段的启动子质粒，启动子活性分析表明，HdHSP70基因启动子活性也比较高，其中pGL-70-2r活性最高，显著高于pGL-70-1r和pGL-70-3r的活性(P＜0.05)。本实验还发现，所有构建的HdHSP70基因缺失片段的启动子的相对荧光活性普遍低于HdHSC70基因。