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目的:探讨叶下珠复方Ⅱ号通过抑制IGF-1R信号通路活化从而发挥抗肝癌作用的新机制,为其临床应用提供新的实验依据。方法:1.IGF-1R表达抑制肝癌Huh7细胞株建立采用siRNA基因沉默技术,依据siRNA靶序列设计原则,针对Huh7细胞IGF-1R序列,设计并合成三对核苷酸干扰序列,克隆入慢病毒pLVX-shRNA1载体,对shRNA表达的重组质粒提取、酶切鉴定,证实其序列与设计序列完全一致。提取纯化高质量的重组质粒,使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T细胞,进行病毒包装,收集病毒液,浓缩,纯化病毒液。用病毒感染Huh7细胞,经筛选后获得稳定感染的细胞株。通过 Western blot 法检测 anti-IGF-1R Huh7 细胞(II 和 12)、Huh7-NC细胞和Huh7细胞中IGF-1R基因和蛋白表达的差异。2.叶下珠复方Ⅱ号对Huh7细胞和anti-IGF-1R Huh7细胞增殖的影响采用MTT法检测不同浓度叶下珠复方Ⅱ号作用48h对Huh7细胞、anti-IGF-1R Huh7细胞增殖的抑制作用效果,并计算出药物半数抑制浓度;设置对照组、叶下珠复方Ⅱ号高剂量组(3.0mg/ml)、低剂量组(1.5mg/ml)、5-FU组(30μg/ml),每组4个复孔,检测药物作用于Huh7细胞及anti-IGF-1R Huh7细胞24h、48h的抑制作用效果。3.叶下珠复方Ⅱ号对Huh7细胞和anti-IGF-1R Huh7细胞凋亡的影响设置细胞对照组、叶下珠复方Ⅱ号高剂量组(3.Omg/ml)、低剂量组(1.5mg/ml)、5-FU组(30μg/ml),每组3个复孔。叶下珠复方Ⅱ号作用于Huh7细胞及anti-IGF-1R Huh7细胞48h后,采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率。4.叶夏珠复方Ⅱ号对Huh7细胞和anti-IGF-1R Huh7细胞基因表达的影响设置细胞对照组、叶下珠复方Ⅱ号高剂量组(3.Omg/ml)、低剂量组(1.5mg/ml)、5-FU组(30μg/ml),每组3个复孔。叶下珠复方Ⅱ号作用于Huh7细胞及anti-IGF-1R Huh7细胞48h后,采用实时荧光定量PCR技术检测叶下珠复方Ⅱ号对Huh7细胞及anti-IGF-1R Huh7细胞中IGF-1R信号通路基因表达的影响。结果:1.与Huh7细胞组比较,Huh7-NC、I1、12细胞组中IGF-1R的表达明显降低(P<0.05),其中I1细胞组中IGF-1R的表达最低,故选取I1细胞作为稳转细胞株,即anti-IGF-1R Huh7细胞株构建成功。2.叶下珠复方Ⅱ号作用于Huh7细胞48h的半数抑制浓度为2.575mg/ml,作用于anti-IGF-1R Huh7细胞48h的半数抑制浓度为1.686mg/ml。叶下珠复方Ⅱ号对Huh7细胞和anti-IGF-1R Huh7细胞的增殖均有明显的抑制作用(P<0.05),且随剂量增加,抑制效果越明显。叶下珠复方Ⅱ号作用24h后,对anti-IGF-1RHuh7细胞的抑制作用比Huh7细胞更明显(P<0.05);叶下珠复方Ⅱ号作用48h后,对anti-IGF-1RHuh7细胞的抑制作用比Huh7细胞更强,差异具有显著性意义(P<0.05)。3.叶下珠复方Ⅱ号作用于Huh7细胞48h后,细胞早期凋亡率对比对照组显著升高(P<0.05),说明叶下珠复方Ⅱ号对Huh7细胞有诱导其早期凋亡的作用。4.叶下珠复方Ⅱ号作用于Huh7细胞和anti-IGF-1R Huh7细胞48h后,Huh7细胞中 IGF-1R 及 PI3K、AKT3、N-RAS、K-RAS、C-RAF 和 ERK1 基因的 mRNA 表达显著降低(P<0.05);anti-IGF-1RHuh7 细胞中 IGF-1R 及 PI3K、AKT3、N-RAS、K-RAS、C-RAF和ERK1等基因的表达显著降低(P<0.05)。与Huh7细胞相比,叶下珠复方Ⅱ治疗后anti-IGF-1R Huh7细胞IGF-1R、PI3K及AKT3基因的mRNA表达水平明显更低(P<0.05)。结论:1.叶下珠复方Ⅱ号可以明显抑制Huh7细胞增殖和诱导Huh7细胞凋亡,作用机制与抑制IGF-1R信号通路活化有关。2.在siRNA技术抑制Huh7细胞IGF-1R表达情况下,使用叶下珠复方Ⅱ号,可以起到抗癌协同作用。