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酚氧化酶原激活系统在昆虫的先天性免疫防御过程中起着十分重要的作用。在先前的研究中,已克隆得到红褐斑腿蝗一个酚氧化酶原基因亚基--CpPPO2。本文以红褐斑腿蝗Catantops pinguis(St(a)l)为研究对象,采用RT-PCR结合RACE技术扩增得到另一个酚氧化酶原基因亚基(CpPPO1)cDNA全长,并对CpPPO1进行比对分析。通过PCR技术结合Northern blot的技术原理,研究酚氧化酶原基因(CpPPO1及CpPPO2)在红褐斑腿蝗11种组织的分布情况,比较了不同发育阶段及不同季节时期两者的表达差异及变化,同时采用大肠杆菌感染成虫,以考查蝗虫在应对外来病原菌感染时酚氧化酶原基因的表达的变化。研究结果如下:
1.通过RT-PCR结合RACE技术克隆得到CpPPO1基因cDNA序列全长。CpPPO1cDNA序列全长为2347 bp,开放阅读框为2187 bp,编码728个氨基酸,推测该蛋白分子量为84,261 Da,等电点为6.91。该基因含有其他昆虫都具有2个保守的铜离子结合位点,位点内包含6个保守的组氨酸残基。与其它昆虫酚氧化酶原基因不同的是,CpPPO1cDNA推导的蛋白含有长为21个氨基酸残基的信号肽序列,预示着其可能作为一种分泌蛋白行使相应的功能。采用BLASTP同源序列搜索结果表明,红褐斑腿蝗PPO1与东亚飞蝗PPO1有高达87％的同源性。通过系统进化分析,结果也表明红褐斑腿蝗与东亚飞蝗的亲缘关系最近。
2.研究CpPPO1及CpPPO2在红褐斑腿蝗11个不同组织中的分布情况,结果显示CpPPO1仅在6个组织中表达,在脂肪体及马氏管中CpPPO1的表达最强,而在气管及直肠中表达较弱；CpPPO2在11个组织中均有不同水平的表达,脂肪体及心脏组织中检测到的表达最强,在中肠及卵巢表达很弱。研究表明,CpPPO1及CpPPO2具有组织表达特异性。
3.研究CpPPO1及CpPPO2在红褐斑腿蝗不同龄期的表达,结果显示CpPPO1除在2龄后期,4龄前期中期不表达,成虫1天,3天仅有极微弱的表达外,在不同龄期的其他阶段均有不同程度的表达,其中在1龄蝗蝻的前期及中期表达最强；CpPPO2在不同龄期各个阶段均表达,其中在5龄后期的表达最强。同一发育阶段,CpPPO1与CpPPO2的表达水平不一致。研究红褐斑腿蝗CpPPO1及CpPPO2在不同季节阶段的表达,结果显示CpPPO1在在6月中旬,7月下旬,10月上下旬及12月上旬的表达量最高,而CpPPO2在1月份,5月上旬,七月下旬,十月中旬有最高的表达水平。研究结果说明CpPPO1与CpPPO2在时间表达上具有特异性。
4.研究红褐斑腿蝗接受外源病原菌大肠杆菌(E.coli)感染后,酚氧化酶基因表达强度变化,结果表明处理组CpPPO1表达比未处理组强,且随着处理时间的延长,CpPPO1的表达逐渐增强,并在处理后24 h和48 h得到两个峰值；CpPPO2在处理24 h及48 h时表达最强,其余三个处理时间点与对照组CpPPO2的表达量较为一致,无明-显上调或下调。红褐斑腿蝗应对外来病原菌挑战时,酚氧化酶原基因表达上调,说明酚氧化酶原的表达在昆虫免疫中起着重要的作用。