【摘 要】
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目的探讨机械敏感型离子通道Piezo1是否通过Ca2+/ROS途径调控小鼠血管平滑肌细胞凋亡。方法饲养的Apo E-/-小鼠和正常C57BL/6J小鼠,获得血管后,通过蛋白质印迹法（Western blot）检测组织蛋白中Piezo1的表达量;通过HE染色和免疫荧光染色检测血管上Piezo1的定位和表达量。体外培养小鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）,使用Piezo1的激动剂Yoda1刺激细胞后,通过
【基金项目】
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镇江社会发展基金项目（SH2015036）； 镇江心血管病临床学研究中心项目（SS2018008）；
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目的探讨机械敏感型离子通道Piezo1是否通过Ca2+/ROS途径调控小鼠血管平滑肌细胞凋亡。方法饲养的Apo E-/-小鼠和正常C57BL/6J小鼠,获得血管后,通过蛋白质印迹法（Western blot）检测组织蛋白中Piezo1的表达量;通过HE染色和免疫荧光染色检测血管上Piezo1的定位和表达量。体外培养小鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）,使用Piezo1的激动剂Yoda1刺激细胞后,通过CCK-8法细胞增殖检测试剂盒评估细胞活力的变化;使用Annexin V-FITC/PI流式细胞术测定细胞的凋亡率;使用Western blot检测Bcl-2、BAX、Caspase-9、cleaved Caspase-9、Casepase-3、cleaved Caspase-3、β-actin、VDAC、Cytochrome c等凋亡相关蛋白表达量;应用JC-10检测线粒体膜电位的变化;使用Fluo-4 AM探针检测细胞内Ca2+的水平;通过2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）探针检测小鼠血管平滑肌细胞中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的水平。最后,使用ROS抑制剂（NAC）和细胞内钙离子螯合剂（BAPTA-AM）分别抑制细胞内ROS和钙离子水平后,检测细胞凋亡率、凋亡相关蛋白的表达和线粒体膜电位的变化。结果（1）在体内实验中,采用Western blot检测了各组中主动脉中Piezo1的表达,通过免疫荧光评估了各组中Piezo1的定位以及表达情况。实验结果显示,与对照组相比,Apo E-/-组Piezo1表达增加（P＜0.05）,动脉粥样硬化斑块中的Piezo1增加更为显著。双重染色显示Piezo1阳性细胞大部分为ɑ-SMA阳性,这证实Piezo1主要在斑块上的VSMCs中表达。（2）在体外实验中,Yoda1（Piezo1激动剂）作用下应用CCK-8检测各组中细胞活力的变化,通过Annexin V-FITC/PI流式细胞术测定各组中细胞的凋亡率,并采用Western blot检测各组中凋亡相关蛋白的表达情况。结果显示,与对照组相比,Yoda1刺激组细胞活力显著下降（P＜0.05）,细胞的凋亡率明显升高（P＜0.05）,细胞线粒体凋亡相关因子BAX、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3蛋白表达量上升,Bcl-2蛋白表达量下降（P＜0.05）;线粒体膜电位也随着Piezo1刺激剂浓度增加而下降（P＜0.05）,Cyto-Cytc也显著增加,Mito-Cyt c表达量呈相反趋势表达（P＜0.05）。提示激活Piezo1通道诱导小鼠血管平滑肌细胞线粒体途径凋亡。（3）在Yoda1刺激VSMCs后,应用钙离子探针和ROS探针检测细胞内钙离子浓度以及ROS水平的变化,结果显示,与对照组相比,Yoda1刺激组钙离子浓度和ROS的水平升高;BAPTA-AM和NAC预处理后VSMCs凋亡率较Yoda1刺激组下降（P＜0.05）,并且削弱了Yoda1刺激组促凋亡分子BAX、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3表达,增加了抗凋亡分子Bcl-2的表达（P＜0.05）;同时线粒体膜电位有所回升（P＜0.05）,线粒体内的细胞色素C进入胞质中减少（P＜0.05）。进一步抑制了小鼠血管平滑肌细胞凋亡。（4）在体外实验中,分别用BAPTA-AM和NAC预处理VSMCs后,结果显示,BAPTA-AM可以抑制Yoda1所导致细胞内Ca2+浓度和ROS水平的升高,然而NAC仅仅可以抑制ROS水平,但对细胞内钙离子浓度无明显影响（P＜0.05）。结论Piezo1通过Ca2+/ROS途径诱导的线粒体依赖的血管平滑肌细胞凋亡。
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