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聚酰胺-胺树状大分子(PAMAM)是一类由中心向外对称发散且高度分枝的纳米级高分子化合物，分子内部的空腔可以用来包裹药物分子，而末端得基团可以通过修饰连接配体、抗体等生物活性物质，分子所带的高密度正电荷可以压缩DNA。PAMAM树状大分子现已广泛应用于生物医药领域，如基因载体、药物载体、磁共振成像对比剂等。虽然PAMAM树状大分子的应用研究已取得了快速发展，但整代PAMAM树状大分子表面有大量氨基基团，在生理pH条件下易质子化而带正电，因此不可避免的具有一定的细胞毒性。利用无毒、水溶性好的免疫惰性大分子聚合物对PAMAM进行修饰是降低毒性、提高生物相容性的有效方法之一。本实验采用不同相对分子质量(MW)的聚乙二醇(PEG)对五代(generation 5，G5)PAMAM进行不同程度的修饰。考察PAMAM的细胞毒性和PEG修饰的保护作用及其机理，探讨PEG的相对分子质量和修饰度对保护作用的影响，并研究PEG修饰对树状大分子的细胞摄取和转染能力的影响。完成的主要工作有：(1)分别用相对分子质量为2 k和5 k的mPEG-SC对G5 PAMAM进行两种氨基取代度修饰，低取代度偶联的PEG数为13、高取代度偶联数为51，分别为G5PAMAM表面氨基数的10％和40％。得到四种PEG-PAMAM化合物，分别为13PEG-2k-PAMAM、51PEG-2k-PAMAM、13PEG-5k-PAMAM和51PEG-5k-PAMAM。用相对分子质量为20 k的mPEG-SC对G5 PAMAM进行修饰，偶联的PEG数为13，得到13PEG-20k-PAMAM。用核磁波谱和红外光谱进行结构表征。(2)应用噻唑蓝法(MTT)考察PAMAM对鼠成纤维细胞(NIH 3T3)的细胞毒作用，结果表明PAMAM的细胞毒性有浓度和时间依赖性。比较PAMAM与PEG-PAMAM的细胞毒性，发现PEG修饰后树状大分子细胞毒性显著降低，13PEG-2k-PAMAM、51PEG-2k-PAMAM和13PEG-5k-PAMAM分别降低1 2、37和34倍，毒性最小的51PEG-5k-PAMAM可以降低105倍。(3)用FITC标记PAMAM和PEG-PAMAM，考察细胞对树状大分子的摄取情况。结果表明，PAMAM可以被细胞快速摄取，PEG-2k修饰对摄取过程没有显著影响，PAMAM、13PEG-2k-PAMAM和51PEG-2k-PAMAM与细胞孵育2 h后阳性细胞率接近100％。相对分子质量较大PEG修饰的13PEG-5k-PAMAM和51PEG-5k-PAMAM的摄取率虽然略低，但也达到了80％。此外，树状大分子细胞摄取过程有温度依赖性，在低温环境条件下摄取率明显降低，说明细胞对树状大分子的摄取是一个耗能过程。PAMAM和PEG-PAMAM有核靶向力，与细胞孵育15 min后即开始在核聚集。进一步用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因考察PAMAM和PEG-PAMAM的转染能力。PAMAM和PEG-PAMAM均能将GFP转运至NIH 3T3细胞并成功表达。调整13PEG-2k-PAMAM和51PEG-2k-PAMAM复合物中的电荷比，可以得到与PAMAM相似的转染效果。(4)通过流式细胞术、荧光分光光度法考察细胞凋亡、胞内ROS含量和线粒体膜电位的变化，发现PAMAM诱发细胞内ROS的增加，损伤细胞膜及线粒体膜，引起线粒体跨膜电位的降低，诱导细胞凋亡。与PAMAM相比，PEG修饰的树状大分子在较高浓度时才会引致细胞凋亡，而且凋亡率明显下降。此外，PEG化可明显抑制胞内ROS的产生和蓄积，维持线粒体膜电位稳定，保护线粒体。说明PEG化是通过拮抗胞内氧化应激损伤而降低PAMAM的细胞毒性的。偶联的PEG链越多、偶联的PEG相对分子质量越大，毒性下降的越明显。(5)以人红细胞考察PAMAM、13PEG-2k-PAMAM、13PEG-5k-PAMAM和13PEG-20k-PAMAM的血液相容性。红细胞溶血实验结果发现5 mg／mL PAMAM的平均溶血率达到7．67±2．25％，13PEG-2k-PAMAM、13PEG-5k-PAMAM和13PEG-20k-PAMAM的平均溶血率在实验浓度范围内均小于5％，低于PAMAM组溶血率(P＜0．05)。用光学显微镜观察细胞形态，结果发现PAMAM和13PEG-2k-PAMAM能够引起红细胞聚集，而13PEG-5k-PAMAM和13PEG-20k-PAMAM与红细胞作用后细胞仍维持正常形态，保持良好的悬浮性。用原子力显微镜(AFM)观察红细胞表面超微结构变化，发现PAMAM和13PEG-2k-PAMAM处理后红细胞变形，红细胞膜被严重破坏，而13PEG-5k-PAMAM和13PEG-20k-PAMAM处理的红细胞膜表面结构与正常红细胞接近，膜表面粗糙度远低于PAMAM处理红细胞。说明PEG的相对分子质量会对树状大分子的血液相容性产生较大影响，相对分子质量较大的PEG修饰的树状大分子血液相容性较好。综上所述，PAMAM细胞毒性的产生主要是通过诱发细胞内ROS的过量产生和蓄积，损伤细胞膜及线粒体膜，引起线粒体损伤，从而诱导细胞凋亡。而PEG化可以通过拮抗胞内氧化应激损伤而降低PAMAM的细胞毒性。偶联的PEG链越多、偶联的PEG相对分子质量越大，毒性下降的越明显。PEG修饰的树状大分子在提高安全性的同时仍具备转染能力，在基因治疗方面有更广阔的应用前景。可以通过热活化、偶联核定位信号等手段来进一步提高PEG-PAMAM的转染效率。