研究背景乳腺癌是世界上威胁女性健康最常见的恶性肿瘤之一。我国乳腺癌的发病率近年来也有明显增加的趋势。目前,乳腺癌的治疗方式仍以手术切除为主,同时结合放疗、化疗、内分泌等疗法。虽然这些措施对乳腺癌的治疗取得了一定进展,但肿瘤术后转移复发和化疗耐药等诸多问题使乳腺癌的最终治疗效果并不十分理想。因此,寻求新的有效治疗方法显得日益迫切。随着分子生物学的迅速发展,人们对乳腺癌的发生、发展机制,特别是与乳腺癌细胞生长、增殖、转移相关的信号传导机制有了深入的了解,针对与乳腺癌发生、发展有关的癌基因及其相关表达产物进行治疗,即分子靶向治疗成为目前乳腺癌治疗研究的新热点。血管内皮生长因子C（Vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C）是血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）家族的新成员,可与内皮细胞膜表面的VEGFR-2和VEGFR-3特异性地结合,促进血管、淋巴管的增生,与肿瘤生长及转移关系密切。近期有研究表明:肿瘤细胞分泌的VEGF-C还可与自身膜表面的受体VEGFR-2/VEGFR-3特异性的结合,促进肿瘤细胞的增殖;并通过上调Bcl-2/Bax比值阻滞化疗药物诱导的细胞凋亡,降低化疗药物的敏感性。VEGF-C在乳腺癌内呈高表达。关于VEGF-C在乳腺癌内的高表达与肿瘤生长、淋巴转移相关性的研究已有大量报道,而关于VEGF-C在乳腺癌内的表达与肿瘤化疗敏感性方面的研究还缺乏报道。鉴于VEGF-C在肿瘤生长、转移及化疗耐药性方面具有重要的调节作用,因此,针对乳腺癌内高表达的VEGF—C展开的基因治疗研究具有重要的意义。目前,以VEGF-C为靶点的基因治疗研究主要有以下几个方面:1)利用抗体封闭VEGF-C或其受体;2)抑制VEGF-C受体的酪氨酸激酶活性;3)利用核酶或反义技术降低VEGF-C及其受体的表达。但是,以上这些方法都有自己的局限性。RNA干扰（RNA interference,RNAi）现象的发现,为以VEGF-C为靶点抑制肿瘤生长及转移,降低化疗耐药性的研究提供了新的方法。RNA干扰是一种广泛存在于高等植物和动物中的由双链RNA介导的、序列特异的同源基因转录后基因沉寂（PTGS）现象。一般认为:RNA干扰效应作用机制是由含19～23个核苷酸的小RNA片段,即小干扰RNA（small interferingRNA,siRNA）作为中介分子,与Dicer酶和其他一些蛋白质共同构成RNA诱导的沉默复合物（RNA inducing silence complex,RISC）,依靠碱基互补规律识别与siRNA同源的mRNA分子,并将其降解。RNA干扰作为一种高效、特异地抑制基因表达的新技术,已广泛应用于基因功能和基因治疗等方面的研究中。在肿瘤基因治疗中,通过人工合成特定癌基因靶向的siRNA,或构建上述siRNA的表达载体,并将它们导入肿瘤细胞中,可以特异性地抑制目的基因的表达。目前,采用RNA干扰技术抑制VEGF表达治疗肿瘤的实验研究已取得了一定进展。而采用RNA干扰技术抑制VEGF-C表达的实验研究却相对滞后,仅限于观察抑制VEGF-C表达后对肿瘤内淋巴管生成及远处器官淋巴转移的影响,而对肿瘤细胞增殖、凋亡及化疗耐药性影响的实验研究目前还尚未见报道。本研究拟采用RNA干扰技术下调人乳腺癌细胞株MCF-7内VEGF-C的表达,观察VEGF-C表达抑制后对MCF-7细胞增殖、凋亡及化疗药物敏感性的影响,以期为RNA干扰技术在乳腺癌基因治疗中应用的可行性提供科学依据。本研究共分三部分内容。第一部分靶向VEGF-C的siRNA表达载体的构建及鉴定目的构建靶向人VEGF-C基因的siRNA表达载体,为下一步研究准备条件。方法1.设计并合成3条互补的编码VEGF-C shRNA和1条阴性对照的寡核苷酸序列,退火后与含有U6启动子的pRNAT-U6.1/Neo线性载体质粒连接,构建形成靶向VEGF-C的重组质粒。2.以重组质粒转化大肠杆菌DH5α。用碱裂解法少量制备质粒DNA,进行PCR产物鉴定和DNA测序验证。用QIAGEN试剂盒大量制备质粒DNA,以备转染用。结果3个靶向VEGF-C的siRNA表达载体和1个阴性对照载体,经PCR产物鉴定和DNA测序证实插入序列正确无误,表明目的片段已正确克隆入载体。结论设计合成了3条针对VEGF-C基因和1条阴性对照的模板寡核苷酸序列,并插入带有U6启动子的表达载体pRNAT-U6.1/Neo,PCR产物和DNA测序证实靶向VEGF-C基因的siRNA表达载体构建成功。第二部分靶向VEGF-C的siRNA表达载体对人乳腺癌细MCF-7内VEGF-C基因表达的影响目的将成功构建的靶向VEGF-C的siRNA表达载体通过阳离子脂质体转染入人乳腺癌细胞MCF-7内,通过RT-PCR、ELISA和免疫细胞化学染色等多种方法检测转染前后乳腺癌细胞MCF-7内VEGF-C mRNA和蛋白表达的变化,以期为下一步以VEGF-C为靶点的RNA干扰技术在乳腺癌基因治疗中的应用提供有力的实验依据。方法1.将成功构建的3个针对VEGF-C的siRNA表达载体pRNAT-VEGF-C-1（简称P-1）、pRNAT-VEGF-C-2（简称P-2）、pRNAT-VEGF-C-3（简称P-3）用Lipofectamine^TM2000转染入人乳腺癌细胞MCF-7内,另设未转染组及转染阴性表达载体pRNAT-Negative（简称P-N）组作为对照。2.显微镜下观察siRNA表达载体内绿色荧光蛋白（GFP）的表达,计数绿色荧光细胞数及细胞总数,计算绿色荧光细胞的发生率,比较各组细胞的转染效率。3.RT-PCR、ELISA、免疫细胞化学染色检测转染前后人乳腺癌细胞株MCF-7内VEGF-C mRNA和蛋白表达的变化。结果1.荧光显微镜下观察MCF-7细胞内GFP的表达。结果显示转染24h后,MCF-7细胞内就出现GFP的大量表达,以48h表达最强。约有70%以上的细胞内都有GFP的表达,各组细胞的转染效率之间没有明显的差别（P＞0.05）。2.RT-PCR检测结果显示:VEGF-C与β-actin分别位于610bp和197bp处。P-N转染组VEGF-C mRNA表达封度较高（98.00%）,在610bp处可见明亮的荧光条带,与空白对照组（98.63%）无明显差异（P＞0.05）。与空白对照组相比,P-1转染组、P-2转染组、P-3转染组细胞的VEGF-C mRNA的表达均有减弱,其表达率分别为38.14%、63.42%、68.00%,差异均有统计学意义（P＜0.05）。其中P-1重组质粒转染的细胞内VEGF-C mRNA表达量最低,干涉效果最明显。3.ELISA检测结果显示:P-N转染组细胞（385.40±31.42 pg/ml）与空白对照组细胞（367.12±34.90pg/ml）相比,细胞培养上清液中VEGF-C含量无明显区别,差异无显著性（P＞0.05）。而P-1转染组（117.81±24.22pg/ml）、P-2转染组（272.81±29.23pg/ml）、P-3转染组（289.60±31.00pg/ml）与空白对照组细胞相比,细胞培养上清液中VEGF-C含量均降低,差异有显著性（P＜0.05）,其中又以P-1转染组细胞培养上清液VEGF-C表达量最低。4.免疫细胞化学染色检测结果显示:与空白对照组相比,P-N转染组细胞浆棕黄色染色最深,几乎与对照组细胞浆染色无明显区别,而P-1转染组、P-2转染组和P-3转染组细胞浆呈浅棕黄色,其中又以P-1转染组细胞浆棕黄色染色表达最浅。结论1.Lipofectamine^TM2000介导靶向VEGF-C的siRNA表达载体导入MCF-7细胞具有转染效率高,方法简便等优点。2.RT-PCR、ELISA、免疫细胞化学染色法从分子和蛋白水平均证实:构建的3个针对VEGF-C的siRNA表达载体（P-1、P-2、P-3）均可有效抑制MCF-7细胞内VEGF-CmRNA和蛋白的表达,其中以P-1表达载体抑制效果最明显。第三部分靶向VEGF-C的siRNA表达载体对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、凋亡及化疗敏感性的影响目的采用MTT法、流式细胞仪检测MCF-7细胞内VEGF-C基因表达抑制后,对MCF-7细胞增殖、凋亡及对化疗药物表阿霉素敏感性的变化;采用Western blot检测RNA干扰技术与化疗药物联合应用后对MCF-7细胞内凋亡抑制蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax表达比率的影响,以期为靶向VEGF-C的RNA干扰技术与化疗相结合的联合治疗在乳腺癌中应用的可行性提供依据。方法1.MTT法检测MCF-7细胞的体外耐药浓度。2.MTT法检测转染siRNA表达载体的细胞联合应用表阿霉素对MCF-7细胞增殖的影响。3.Annexin V/PI法检测转染siRNA表达载体的细胞联合应用表阿霉素对MCF-7细胞早期凋亡的影响。4.Western blot检测转染siRNA表达载体的细胞联合应用表阿霉素对MCF-7细胞内凋亡抑制蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax表达比率的影响。结果1.MTT检测结果显示:低浓度的表阿霉素单独作用于乳腺癌细胞,对细胞增殖能力并无明显的抑制作用。当表阿霉素浓度达到8umol/L以上时,才显著抑制MCF-7细胞的增殖,并且抑制率随药物浓度的增加而上升。2.MTT检测结果显示:无论加药组和未加药组,P-1转染组细胞的存活率都明显低于P-N转染组和未处理细胞组,差异具有显著性（P＜0.05）,而P-N转染组和未处理细胞组在用药前后细胞的存活率之间未见明显差异（P＞0.05）。当加入表阿霉素8umol/L（该药物浓度细胞增殖抑制率小于5%）作用24h后,P-1转染组细胞的存活率明显下降,由78.63%下降到38.54%,差异有显著性（P＜0.05）。3.流式细胞仪检测结果显示:用药前,P-1转染组细胞凋亡率为13.10%。加入8umol/L表阿霉素作用24h后,P-1转染组内凋亡细胞增加,凋亡率上升至38.91%,两者相比差异显著（P＜0.05）,并且与P-N转染组和未处理细胞组相比差异显著（P＜0.05）。P-N转染组和未处理细胞组用药前以活细胞为主,仅有少量凋亡细胞,加入表阿霉素后细胞凋亡率略有上升,两组细胞凋亡率之间没有明显差异（P＞0.05）。4.Western blot结果显示:未加药组,P-1转染组细胞内Bcl-2蛋白的表达水平与对照组相比下调（P＜0.05）。药物处理后,Bcl-2蛋白表达水平的下调比靶向VEGF-C的siRNA表达载体单独作用时更明显（P＜0.05）,而Bax蛋白的表达水平在用药前后无明显改变,从而导致Bcl-2/Bax比值下降。P-N转染组和未处理细胞组用药前后Bcl-2和Bax蛋白的表达水平未见明显差异（P＞0.05）。结论靶向VEGF-C的siRNA表达载体联合应用表阿霉素可明显地抑制MCF-7细胞增殖、促进凋亡、提高对化疗药物的敏感性,这一机制可能是通过下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,导致Bcl-2/Bax的比值下降,诱导细胞凋亡来实现的。创新性1.将构建的靶向VEGF-C的siRNA表达载体,通过Lipofectamine^TM2000首次转染入人乳腺癌细胞株MCF-7内,并成功地抑制了MCF-7细胞内VEGF-CmRNA和蛋白的表达,为RNA干扰技术在乳腺癌基因治疗中的进一步应用奠定了基础。2.首次观察了靶向VEGF—C的siRNA表达载体与表阿霉素联合应用后,可有效地抑制MCF-7细胞增殖、促进凋亡及提高对化疗药物表阿霉素的敏感性,为靶向VEGF-C的RNA干扰技术与化疗药物联合应用的可行性提供了实验依据。3.首次通过检测Bcl-2/Bax比值的变化,研究了MCF-7细胞内VEGF-C表达抑制后,提高化疗药物敏感性的机制。首次证实:靶向VEGF-C的siRNA表达载体抑制VEGF-C表达后,可通过下调Bcl-2/Bax比值,诱导细胞凋亡来提高对化疗药物的敏感性,为探索乳腺癌耐药机理提供了理论依据。