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目的 先天性心脏病(CHD)是人类一种非常普遍和具有破坏性的出生缺陷性疾病,其发生与gata4基因突变有关。gata4参与调控心肌细胞中某些特定基因的表达,对心肌细胞的形成、心脏前体细胞的迁移和分化、心瓣膜及间隔发育等具有重要作用。基因敲除技术构建gata4基因敲除的动物模型有助于人类先天性心脏病致病机制和治疗的进一步研究。类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的靶向修饰技术是目前广泛使用的成熟的基因敲除技术,它主要含有两个重要的结构域：特异性识别核酸的靶点识别域和切断DNA序列的核酸酶功能结构域。人工构建针对gata4基因第一外显子的重组核酸酶TALEN,在体内对特定位点产生DNA双链断裂,利用细胞自身DNA损伤后的NHJE引入基因突变、敲除或敲入,实现基因定点修饰的目的,并建立斑马鱼先天性心脏病gata4基因敲除的动物模型。方法 采用生物信息学方法分析斑马鱼gata4基因的编码序列,利用靶位点设计软件选择合适的打靶位点,针对第一外显子设计了一对靶点。使用单元组装法克隆构建特异性TALE靶点结合域,组装完成后通过菌液PCR、测序验证TALE是否组装正确。将TALE靶点结合域克隆到真核表达载体pCS2-PEAS和pCS2-PERR中,得到gata4基因的左、右半位点的重组核酸酶质粒,通过菌液PCR、酶切、测序验证打靶载体是否正确。线性化打靶载体DNA,使用SP6体外转录试剂盒将其转录成mRNAs,通过显微注射的方式注入斑马鱼单细胞期受精卵中,酶切法检测TALEN的体内活性。待注射的斑马鱼性成熟后,通过逐条剪尾、酶切检测发生基因突变的斑马鱼,TA克隆测序确认突变体的基因型,筛选出gata4基因敲除的斑马鱼。结果 菌液PCR、酶切、测序结果均证实成功地构建出了正确的针对gata4第一外显子左、右半位点的重组核酸酶,斑马鱼胚胎体内活性检测发现TALEN的效率为35.18%,通过逐条剪尾、PCR、酶切法检测成功地筛选出了19条gata4基因发生突变的斑马鱼,测序结果显示斑马鱼突变体产生了不同片段大小、不同位置的gata4基因敲除。结论 成功构建gata4基因敲除的斑马鱼模型,为进一步研究人类gata4基因突变引起先天性心脏病的致病机制及治疗研究提供了良好的动物模型。