几丁质是昆虫的表皮和围食膜等结构的重要组分,在昆虫生长发育的各个时期都需要一定量的几丁质酶来调节几丁质含量,以适应周期性的蜕皮和变态发育。几丁质酶还和昆虫围食膜的合成和降解,含几丁质食物的降解,以及外源病原微生物的防御有关。研究昆虫几丁质酶基因可以有助于从基因水平对昆虫进行防治,同时可以有助于研发书安静友好型生物农药。本文以重要的水稻害虫二化螟为研究对象,对二化螟八个几丁质酶基因的功能进行了研究,主要结果如下:1.二化螟八个几丁质酶基因的克隆通过对实验室已有的二化螟转录组数据进行搜索,获得了八个二化螟几丁质酶基因的序列片段。其中CsCht5的序列是完整的,其余的七个几丁质酶基因序列不完整。利用RACE技术,成功克隆得到了这7个几丁质酶基因(CsCht6、CsCht7、CsCht8、CsCht9、CsCht10、CsCht11、CsCht12)。将这8条几丁质酶基因与NCBI数据库中的其它几丁质酶基因进行BlastX比对,比对决结果显示它们之间高度相似,现将已获得的8条几丁质酶基因序列提交到NCBI数据库中。对这八个基因蛋白序列的分子量、等电点预测发现,CsCht5、CsCht6、CsCht7、CsCht9、CsCht10 和 CsCht11,的分子量在45-70KD之间,PI值也在5-7之间;而CsCht8的分子量为32.09,PI值为4.58,CsCht12的分子量为44.42,PI值为4.78。同时发现8条几丁质酶蛋白均含有α螺旋、延伸链、β折叠和无规则卷曲等二级结构。2.二化螟八个几丁质酶基因的表达分析在二化螟不同发育时期选取28个时间点,利用定量PCR技术测定了八个几丁质酶基因在二化螟不同龄期的表达量情况。结果显示,CsCht5、CsCht6、CsCht8和CsCht10在二化螟蛹期高表达,CsCht8和CsCht12在二化螟幼虫期高表达,CsCht7随着龄期呈周期性变化,CsCht9在6龄末高表达,CsCht11在6龄初高表达。结果表明CsCht5、CsCht6和CsCht10可能和二化螟的羽化有关。CsCht7,CsCht8 CsCht12可能和二化螟的蜕皮和防御有关。CsCht9可能和二化螟的化蛹有关,CsCht11可能和二化螟的防御有关。选取二化螟头、马氏管、中肠、脂肪体和表皮等不同组织,研究了八个几丁质酶基因在二化螟不同组织中的表达量情况。定量PCR结果显示,CsCht5、CsCht6和CsCht7在二化螟表皮高表达,推测其可能和二化螟表皮几丁质的合成和降解有关。CsCht8和CsCht9在二化螟头部高表达,推测其可能和二化螟头壳的蜕裂等有关。CsCht1O、CsCht1和CsCht12在二化螟中肠中高表达,推测其可能和二化螟中场内围食膜的合成和降解,含几丁质食物的降解,以及外源病原微生物的防御有关。3.二化螟八个几丁质酶基因的RNA干扰利用RNA干扰技术对二化螟的八个几丁质酶基因进行功能分析,结果显示:CsCht5、CsCht6和CsCht8对二化螟的羽化率和羽化时间有影响。在蛹期相应时间注射siCsCht5、siCsCht6和siCsCht8后,发现处理组的羽化率比对照组低,且处理组的蛹出现发黑死亡的现象。表明CsCht5、CsCht6和CsCht8可能和二化螟蛹的发育及羽化有关。注射siCsCht7和siCsCht9后出现化蛹提前的现象,表明CsCht7和CsCht9可能和二化螟的发育有关。CsCht10、CsCht11和CsCht12对二化螟的化蛹影响不明显。4.白僵菌处理和干扰几丁质酶基因对二化螟的联合毒杀效果白僵菌是一种半知菌类的虫生真菌,能够侵染约707种昆虫。为探索八种几丁质酶基因在害虫控制中作用,本实验选择白僵菌作为外源微生物来侵染几丁质酶基因被干扰后的二化螟。结果显示:干扰CsCht5和CsCht6后,处理组试虫的死亡时间相较于对照组有所提前,死亡率也有所增加。干扰CsCht7、CsCht8、CsCht9、CsCht11和CsCht12后,处理组和对照组在死亡率和死亡时间上差异不显著。仅沉默CsCht10对二化螟化蛹没有受到影响,死亡率为零。但在注射siCsCht10一天后,用白僵菌进行侵染处理,二化螟死亡率显著升高,结果表明CsCht10与二化螟的防御有关。