背景:慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）已经成为全球公共卫生问题。肾脏纤维化（Renal fibrosis,RF）,尤其是肾小管间质纤维化不仅是各种CKD进行性损伤的标志和共同途径,也是肾功能不全的主要决定因素和可靠的预后指标,主要表现为肾小球硬化、肾小管萎缩和肾间质纤维化。CKD的病因多种多样,包括各种原发性肾小球疾病与继发性肾损伤,如糖尿病肾病、高血压肾病、狼疮肾炎、抗中性粒细胞胞浆抗体（Anti-neutrophil cytoplasmic antibody,ANCA）相关性血管炎（ANCA-associated vasculitis,AAV）等。不论何种原因导致的CKD,都会引起肾单位丢失、微血管损伤、肾脏代谢改变、氧化应激压力增强、慢性炎症持续存在等,最终导致肾小管间质纤维化,肾功能进行性下降发展至终末期肾脏病（End stage renal disease,ESRD）。肾小管间质纤维化主要表现为肾小管间质中有大量细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）沉积。虽然ECM在肾小管间质的合成是肾脏修复的过程,但是这些大量沉积的ECM反过来又会加重肾小球与肾小管的损伤,加速肾功能恶化。因此,及时阻止或减少肾小管间质ECM的聚集可能会有效抑制肾功能的恶化,避免CKD患者进展为ESRD。在免疫因素或非免疫因素导致的肾脏损伤中,CD4+T细胞都参与了急性或慢性的肾脏损伤。CKD患者和动物模型的肾脏组织病理显示,肾小管间质纤维化总是伴随小管间质大量巨噬细胞与CD4+T细胞的浸润。这些发现提示CD4+T细胞在肾小管间质纤维化进展中发挥重要作用。既往的研究表明,在肾小管间质纤维化模型中,通过抗CD4单克隆抗体清除体内CD4+T细胞后,肾小管间质中沉积的ECM明显减少。此外,有文献报道,在利用CD4+T细胞缺失转基因小鼠构建的肾小管间质纤维化模型中,肾小管间质ECM的沉积明显减少。还有研究发现肾小管间质纤维化小鼠的肾脏中有大量高表达CCR7的CD4+T细胞浸润,在采用抗CCR7单克隆抗体阻断CCR7与配体的结合后,肾小管间质浸润的CD4+T细胞数量明显减少。同时,肾小管间质纤维化程度也得到明显改善。以上发现从不同角度证明了CD4+T细胞参与了肾小管间质纤维化的发生及发展进程。但是,CD4+T细胞如何促进肾小管间质纤维化、又如何迁移到肾小管间质的机制仍不清楚。有研究发现Wnt/β-catenin信号通路能够加重肾小管间质纤维化程度。在多种肾小管间质纤维化动物模型中,包括单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）、5/6肾切除、缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury,IRI）等,纤维化肾脏中Wnt/β-catenin信号通路明显活化。而小分子化合物ICG-001抑制β-catenin的功能后,UUO模型中的肾小管间质纤维化程度明显缓解,提示Wnt/β-catenin信号通路可能加重肾小管间质纤维化程度。而T细胞因子1（T cell factor 1,TCF-1）作为目前Wnt/β-catenin信号通路下游经典的转录因子,在肾小管间质纤维化中的作用还没有明确报道。TCF-1又是CD4+T细胞发育与分化的重要转录因子。在敲除TCF-1后,病毒感染的小鼠脾脏中CD4+T细胞不能分化为正常的滤泡辅助性T细胞（Follicular helper T cell,Tfh）。除了CD4+T细胞的分化,TCF-1还影响CD4+T细胞的功能,敲除TCF-1的CD4+T细胞分泌IL-4与IL-21明显减少,而分泌颗粒酶B（Granzyme B）却有所增加。但是,TCF-1是否调节肾小管间质浸润的CD4+T细胞从而影响肾小管间质纤维化程度仍不清楚。方法:将Tcf7fl/fl小鼠与CD4-Cre转基因小鼠杂交,构建CD4+T细胞内条件性敲除TCF-1的CD4-Cre-Tcf7fl/fl(Tcf7–/–)小鼠;同时将ERT2-Cre基因敲入小鼠与Tcf7fl/fl小鼠杂交构建,得到他莫昔芬诱导敲除TCF-1的ERT2-Cre-Tcf7fl/fl(i Tcf7–/–)小鼠。通过这2种转基因小鼠构建UUO模型,观察TCF-1对肾小管纤维化的作用。采用RT-q PCR观察肾脏中相应指标的m RNA水平、采用苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）、马松三色染色（MTS）及天狼猩红（Sirus red）等多种化学染色方法观察肾脏的大体形态、炎症浸润与纤维蛋白沉积水平。采集NCBI数据库中纤维化肾脏单细胞测序数据集,分析纤维化肾脏中的主要细胞构成,以及TCF-1的表达定位。此外,通过免疫荧光（Immunofluorescence,IF）和免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色观察肾脏中纤维化蛋白fibronectin和collagenα-1（Ⅰ）（COL1A1）的表达情况与分布位置,了解CD4+T细胞与TCF-1+细胞的浸润程度。采用多色流式细胞术观察纤维化肾脏中浸润的CD4+T细胞的表型、功能与亚群变化。为进一步探讨其可能的分子机制,通过流式细胞分选术分选脾脏CD4+T细胞,采用染色质免疫共沉淀-定量聚合酶链式反应（Chromatin immunoprecipitation-quantative polymerase chain reaction,Ch IP-q PCR）观察TCF-1是否能直接结合Ccr7增强子区域。收集175例在新桥医院明确诊断的CKD患者肾脏组织切片,通过免疫荧光观察肾脏浸润的TCF-1+细胞,分析其浸润数量与肾小管间质纤维化程度的关系。进一步对不同CKD病种进行分层分析,结合课题组前期主要研究方向,目前重点分析了其中32例AAV患者,通过IF染色及多色流式细胞术（Flow cytometry,FCM）,观察了其外周血CD4+T细胞及其亚群,以及肾组织浸润的CD4+T细胞与TCF-1+细胞。此外,采用ELISA检测AAV患者血清细胞因子水平和ANCAs滴度。通过Spearman相关性检验,分析AAV患者肾脏和外周血CD4+T细胞亚群与肾小管间质纤维化及临床活动性指标之间的相关性。结果:1.UUO肾脏中TCF-1的m RNA与蛋白水平均明显升高（p＜0.001）。他莫昔芬诱导敲除TCF-1后,UUO肾脏中纤维蛋白沉积明显减少（p＜0.001）、fibronectin（p＜0.001）和COL1A1（p＜0.001）的表达明显减少。2.通过单细胞测序数据挖掘,发现纤维化肾脏中有TCF-1的表达主要定位于T淋巴细胞。进一步IF染色与多色流式细胞术确定UUO肾脏中高表达的TCF-1主要定位于CD4+T细胞。CD4+T细胞内条件性敲除TCF-1后,UUO肾脏纤维蛋白沉积明显减少（p＜0.001）、fibronectin（p＜0.001）和COL1A1（p＜0.001）的表达明显减少;UUO肾小管间质浸润的CD4+T细胞的数量明显减少（p＜0.001）,但是浸润的CD4+T细胞亚群没有明显变化。3.CD4+T细胞内条件性敲除TCF-1后,UUO肾脏间质浸润的CD4+T细胞表面CCR7表达明显减少（p＜0.001）。CD4+T细胞内源性TCF-1可以直接与Ccr7+18.6k和+23.3k这两个增强子区域结合。4.CKD患者（包括AAV患者）肾脏小管间质浸润的TCF-1+细胞数量与肾小管间质纤维化程度呈正相关（ρ=0.412,p＜0.001）。在AAV患者中,肾脏小管间质浸润的CD4+T细胞数量与肾小管间质纤维化程度呈正相关（ρ=0.720,p＜0.001）。AAV患者外周血CD4+T细胞（ρ=0.072,p=0.726）及其亚群Tfh细胞（ρ=–0.150,p=0.465）和Tph细胞（ρ=–0.038,p=0.853）与肾小管间质纤维化程度没有相关性。5.AAV患者外周血CD4+T细胞亚群Tph细胞与伯明翰血管炎活动性评分（Birmingham Vasculitis Activity Score,BVAS）（ρ=0.431,p=0.014）、ESR（ρ=0.505,p=0.004）、CRP（ρ=0.647,p=0.004）、NLR（ρ=0.447,p=0.013）呈正相关。AAV患者Tph细胞与血清TNF-α（ρ=0.449,p=0.005）、IL-4（ρ=0.688,p＜0.001）、IL-21（ρ=0.709,p＜0.001）、IL-12（ρ=0.504,p=0.001）、MPO-ANCAs（ρ=0.711,p＜0.001）呈正相关,但是与血清IL-10水平呈负相关（ρ=–0.684,p＜0.001）。此外,AAV患者外周血Tph细胞比健康对照明显升高（p＜0.001）,在诱导缓解治疗后,明显下降（p＜0.01）。结论:1.内源性TCF-1直接与Ccr7增强子结合上调CCR7表达,促进CD4+T细胞浸润肾间质,加重肾小管间质纤维化程度。2.CKD患者肾间质浸润的CD4+T细胞及TCF-1+细胞数量与肾小管间质纤维化程度呈正相关。3.AAV患者外周血中CD4+T细胞亚群Tph细胞明显升高,可能通过分泌IL-4和IL-21促进MPO-ANCAs的产生,从而发挥其致病作用。