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目的:斑马鱼作为一种重要的脊椎动物,凭借体型小、生命周期短和繁殖量大等特点被广泛应用于多种疾病模型的研究。斑马鱼受精后48 h,中性粒细胞即发挥作用;72 h至3 w的斑马鱼幼鱼阶段处于只有固有免疫的特殊时期。斑马鱼免疫系统的发育与成熟过程与人类极为相似,且基因组与人类高度同源,成鱼既有固有免疫又有适应性免疫,是研究机体病原生物感染后免疫应答很好的模式生物。为研究沙门菌质粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence genes,spv)对机体感染与免疫的影响,本研究用鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar typhimurium,S.typhimurium,STM)野生株STM-WT和缺失spv基因的突变株STM-Δspv,第一部分用受精后72 h只有固有免疫的斑马鱼幼鱼模型,探讨该基因对机体感染与固有免疫功能的影响;第二部分建立8月龄具有适应性免疫的成鱼感染模型,探讨spv基因对机体感染及Th1/Th2免疫应答的影响,为进一步阐明沙门菌质粒毒力基因spv的致病机制和对机体免疫功能的影响提供理论和实验依据。方法:1.沙门菌质粒毒力基因spv对幼鱼感染及固有免疫功能的影响(1)沙门菌在斑马鱼幼鱼体内的播散斑马鱼感染按本实验室已建立的幼鱼感染模型方法进行,用红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)标记的鼠伤寒沙门菌野生株STM-WT和突变株STM-Δspv,浸染受精后72 h(hours post-fertilization,hpf)的斑马鱼幼鱼,为STM-WT组和STM-Δspv组,每组30条,感染后2、4和8 h分别取10条用荧光显微镜观察细菌在体内的播散情况。(2)沙门菌质粒毒力基因spv对中性粒细胞募集的影响用鼠伤寒沙门菌野生株STM-WT和突变株STM-Δspv感染72 hpf斑马鱼幼鱼,以上两感染组每组30条,另设对照组10条鱼,收集对照组和感染后2、4和8h各10条斑马鱼,固定后用可对中性粒细胞颗粒进行着色的苏丹黑染色,显微镜观察中性粒细胞募集情况。(3)沙门菌质粒毒力基因spv对巨噬细胞吞噬功能的影响设对照组、STM-WT和STM-Δspv感染后2、4和8 h组,每组10条,在72 hpf斑马鱼培养液中加入中性红染液,根据感染后巨噬细胞吞噬染料程度判断细胞功能。于不同时间点加入鼠伤寒沙门菌野生株STM-WT和突变株STM-Δspv使其分别浸染2、4和8h,将幼鱼麻醉后置显微镜下观察巨噬细胞着色情况。(4)沙门菌质粒毒力基因spv对巨噬细胞吞噬后细菌存活的影响用鼠伤寒沙门菌野生株STM-WT和突变株STM-Δspv感染72 hpf幼鱼,每感染组40条鱼,另设对照组10条,收集对照组及感染后2、4、8和12h各10条斑马鱼,分离巨噬细胞后进行胞内菌落计数(colony-forming unit,CFU)。2.沙门菌质粒毒力基因spv对成鱼感染及Th1/Th2免疫应答的影响(1)沙门菌-斑马鱼成鱼感染模型的建立用103、104、105、106和107 CFU鼠伤寒沙门菌野生株STM-WT口饲感染8月龄的成鱼,每组10条,观察各剂量下对成鱼的存活及感染情况,绘制3周生存率曲线。用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative PCR,q PCR)检测肝脏Th1型细胞特异性T-box家族的新型转录因子(T-box factor expressed in T-cells,T-bet,亦称TBX21)基因tbx21和Th2细胞特异性的转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein3,GATA-3)基因gata3 m RNA转录水平;Th1型细胞因子γ干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)、白介素12(interleukin-12,IL-12)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因IFN-γ、IL-12和TNF-α以及Th2型细胞因子IL-4、IL-10和IL-13基因IL-4、IL-10和IL-13的m RNA转录水平,计算Th2/Th1相对表达量比值并确定用于后续实验的合适感染菌量。(2)沙门菌质粒毒力基因spv对斑马鱼成鱼感染的影响用上述条件建立的成鱼感染模型,设对照组、STM-WT和STM-Δspv组,以105 CFU STM-WT和STM-Δspv口饲后1 d、7 d和14 d,每时间点取5条鱼,解剖取出肝脏和肠道。分别进行CFU、苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色)后光镜下观察和透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察肠道超微结构变化。(3)沙门菌质粒毒力基因spv对Th1/Th2免疫应答的影响设对照组、STM-WT和STM-Δspv组,用STM-WT和STM-Δspv口饲后7 d、14 d,每时间点取5条鱼,取出斑马鱼肝脏和肠道,提取组织RNA,q PCR检测tbx21、gata3以及Th1型细胞因子基因IFN-γ、IL-12和TNF-α,Th2型细胞因子基因IL-4、IL-10和IL-13的m RNA转录水平,为显示Th1/Th2免疫偏移,计算gata3/tbx21和IL-4/IFN-γ的相对表达量比值。同时用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测Th1型细胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-α,Th2型细胞因子IL-4、IL-10和IL-13的含量。结果:1.沙门菌质粒毒力基因spv对幼鱼感染及固有免疫功能的影响(1)沙门菌在斑马鱼幼鱼体内的播散:荧光显微镜下观察结果显示,感染后2 h两组斑马鱼体内均有少量带有红色荧光的细菌播散,组间未见差异;感染后4 h红色荧光标记的野生株STM-WT组(RFP-STM-WT)头部及卵黄囊部位有较明显的红色点状聚集,而突变株STM-Δspv组(RFP-STM-Δspv)只有少量红色点状;感染后8 h RFP-STM-WT组口周出现大量的红色细菌聚集。(2)沙门菌质粒毒力基因spv对中性粒细胞募集的影响感染前未见中性粒细胞聚集的黑色颗粒;感染后随着时间的延长,黑色颗粒增多;感染后4 h和8 h STM-Δspv组的黑色颗粒均显著多于STM-WT组(P<0.05)。(3)沙门菌质粒毒力基因spv对巨噬细胞吞噬功能的影响感染前未见明显的红色点状聚集;从感染后2 h到8 h,可见越来越多的红色点状聚集;感染后2、4和8 h三个时间点STM-WT组红色点状聚集均少于STM-Δspv组,感染后8 h最为显著(P<0.05)。(4)沙门菌质粒毒力基因spv对巨噬细胞内菌落计数的影响胞内CFU计数结果显示,菌量随着感染时间的延长递增,感染后4h、8 h和12 h STM-WT组CFU均显著高于STM-Δspv组(P<0.05)。2.沙门菌质粒毒力基因spv对成鱼感染及Th1/Th2免疫应答的影响(1)沙门菌-斑马鱼成鱼感染模型的建立用105 CFU感染2周后斑马鱼全部存活,第15天开始出现死亡,在3周后死亡率达50%;感染后3周解剖发现,肝脏、脾脏和肠道有明显红肿和糜烂;肝脏Th1和Th2型细胞相关基因和细胞因子m RNA转录水平明显向Th2偏移。(2)沙门菌质粒毒力基因spv对成鱼感染的影响脏器组织CFU结果显示,随着感染时间增加,肝脏和肠道细菌量均增多,但STM-WT组均显著高于STM-Δspv组(P<0.05)。肝脏HE染色见随感染时间增加,STM-WT组肝脏有大量空泡变性,且局部有炎性细胞浸润;STM-Δspv组感染后1d和7 d肝脏组织未见空泡变性,感染后14 d出现空泡变性,但少有炎性细胞浸润。肠组织HE染色见STM-WT组中随时间增加肠壁变薄,肠上皮微绒毛排列不整,并有炎性细胞浸润。STM-Δspv组在感染后1 d和7 d肠壁厚度未见明显改变,微绒毛排列较整齐,感染后14 d出现轻微紊乱。透射电镜下见未感染的斑马鱼对照组,肠上皮排列整齐,细胞界限清晰,游离面有紧密整齐的微绒毛;STM-WT组感染后1 d可见肠道微绒毛断裂,上皮细胞形态未见明显改变;感染后7 d细胞界限模糊,肠腔和细胞内均见有细菌分布;STM-Δspv组感染后1 d与对照组无明显差别,感染后7 d微绒毛有轻微断裂,细胞结构也有改变。(3)沙门菌质粒毒力基因spv对Th1/Th2免疫应答的影响:q PCR检测结果显示STM-WT组感染后14 d,肝脏和肠道中gata3/tbx21和IL-4/IFN-γ的相对表达比值均显著上升(P<0.05);在感染后14 d,STM-WT组IL-12和TNF-α的表达水平显著低于STM-Δspv组,IL-10和IL-13的表达水平显著高于STM-Δspv组(P<0.05)。ELISA检测结果显示,感染7 d和14 d后,肝脏和肠道中STM-WT组IFN-γ含量均显著低于STM-Δspv组(P<0.05);感染后14 d,STM-WT组IL-12和TNF-α的含量显著低于STM-Δspv组,IL-4和IL-10的含量STM-WT组显著高于STM-Δspv组(P<0.05);肝脏中IL-13的含量未见明显差异,但在肠道中感染7 d和14 d后,STM-WT组均显著高于STM-Δspv组(P<0.05)。结论:1.沙门菌质粒毒力基因spv通过抑制中性粒细胞和巨噬细胞向炎症部位的趋化、聚集及吞噬杀伤,利于病原菌逃逸机体的固有免疫反应,从而促进细菌在体内的播散加重感染。2.构建的沙门菌-斑马鱼成鱼感染模型,能反映机体感染和免疫功能的变化,可用于研究适应性免疫Th1/Th2免疫应答,为进一步研究鼠伤寒沙门菌感染与免疫机制提供了很好的实验工具。3.沙门菌质粒毒力基因spv通过抑制Th1型细胞基因tbx21的转录和细胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-α的表达,促进Th2型细胞基因gata3的转录和细胞因子IL-4、IL-10和IL-13的表达,使Th1/Th2发生免疫偏移,增强细菌毒力从而加重感染。