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枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)NCD-2菌株作为生防菌株能有效防治作物土传病害。生防微生物在植物根际有效的定殖是其抑制土传病害的重要前提。前期研究表明，NCD-2菌株的根际定殖能力影响其生防效果。为了明确NCD-2菌株的根际定殖特性，本研究构建了GFP标记的NCD-2菌株，分析了其在棉花根部的定殖特点;NCD-2菌株可产生脂肽类抗生素surfactin和fengycin，本研究分析了脂肽类抗生素surfactin和fengycin对NCD-2菌株根际定殖的影响;明确了PhoR/PhoP双组份系统对NCD-2菌株中脂肽类抗生素合成的影响，进一步通过蛋白质组学技术(iTRAQ)和转录组技术分析了NCD-2菌株中受PhoR/PhoP双组份系统调控的蛋白或基因;通过生物信息学分析，明确了脂肽类抗生素合成的相关基因，并对其中3个差异基因进行了功能分析。主要结果如下:
1.明确了枯草芽胞杆菌NCD-2菌株在棉花根部的定殖特征。
为了解NCD-2菌株的定殖特征，本研究利用穿梭载体pAD123筛选NCD-2菌株中组成型表达的启动子，利用该启动子构建了GFP标记的NCD-2菌株。在共聚焦显微镜下检测GFP标记的NCD-2菌株生物膜形成情况，结果表明，GFP标记的NCD-2菌株可以形成具有三维立体结构的生物膜。共聚焦显微镜下定性观察GFP标记的NCD-2菌株在棉花幼苗根部的定殖，结果表明，NCD-2菌株主要定殖在根尖的伸长区和分生区部位。分别在灭菌土和非灭菌土中通过平板计数法和qPCR分析NCD-2菌株在棉花侧根、主根和根尖上的群体数量。结果表明，平板计数法和qPCR技术显示相似的定殖趋势。在非灭菌土中，NCD-2菌株在根尖的种群数量最多，侧根中定殖数量相对较少而在主根中定殖数量最少。NCD-2菌株在灭菌土中的定殖特征与非灭菌土中基本相似即NCD-2菌株在根尖的种群数量最多，但在接种后21d到35d群体数量有所差异，即NCD-2菌株在主根中的群体数量高于侧根部分。研究表明，NCD-2菌株主要定殖在棉花根部的根尖部位，且在根尖的伸长区和分生区部位更有定殖优势。
2.明确了脂肽类抗生素surfactin和fengycin在NCD-2菌株防治棉花黄萎病中的功能。
分别获得了在NCD-2菌株中丧失surfactin合成能力的突变子ΔSrfAA和同时丧失surfactin和fengycin合成能力的突变子ΔFenC/srfAA。分别比较了NCD-2野生型菌株及突变菌株的溶血活性、群集运动、生物膜形成能力和抑菌活性，在NCD-2菌株中surfactin在溶血活性、群集运动和生物膜形成能力方面发挥主要作用，而fengycin在抑制病原菌生长方面发挥主要作用。比较了野生型菌株NCD-2与突变菌株在棉花根际的定殖能力，结果表明，与野生型菌株相比，突变菌株ΔFenC在棉花根际的种群数量略有减少，而突变菌株ΔSrfAA和ΔFenC/srfAA在棉花根际的种群数量显著降低。RT-qPCR技术检测结果表明，敲除surfactin合成相关基因srfAA或fengycin合成相关基因fenC后降低了生物膜形成相关基因kinC、spo0A、epsA和tasA的表达。检测NCD-2野生型菌株及突变菌株对棉花黄萎病的防治效果，结果表明，surfactin和fengycin在NCD-2菌株防治棉花黄萎病中均发挥重要作用。此外，surfactin和fengycin在溶血活性，群集运动、生物膜形成能力、根际定殖以及生防效果中具有协同增效的作用。表明surfactin和fengycin分别通过提高NCD-2菌株的定殖作用和抑制病原菌生长来达到提高NCD-2菌株生防效果的目的。
3.明确了PhoR/PhoP双组份系统正调控surfactin的合成。
分析了PhoR/PhoP双组份对NCD-2菌株中surfactin合成的影响。在低磷培养基中，同NCD-2野生型菌株相比，ΔPhoR和ΔPhoP突变子的溶血活性、排油能力和生物膜形成能力显著降低，而在高磷培养基中野生型菌株和突变菌株之间差异不显著。通过FPLC色谱分析技术证明NCD-2菌株可以产生surfactin，并发现在低磷条件中，NCD-2野生型菌株所产生的surfactin分别是ΔPhoR和ΔPhoP突变子的2.3和6.4倍。RT-qPCR技术分析表明PhoR和PhoP正调控surfactin的合成，在低磷环境下，ΔPhoR和ΔPhoP突变子中surfactin合成酶基因srfAA的表达量比NCD-2野生型菌株均降低了2.1倍，而在高磷培养基中srfAA基因在ΔPhoR和ΔPhoP突变子中仅降低了0.9倍。构建ΔPhoR和ΔPhoP突变子的互补菌株，该互补菌株均能使突变子的性状恢复到野生型水平。在NCD-2菌株中，PhoR/PhoP双组份系统正调控脂肽类抗生素surfacfin的合成。
4.明确了受PhoR/PhoP双组份系统调控的基因及相关途径。
通过iTRAQ定量蛋白质组学分析技术，比较了NCD-2野生型菌株和突变菌株ΔPhoP、ΔPhoR和ΔPhoR/P的差异蛋白。结果表明，与野生型菌株相比，ΔPhoR菌株差异蛋白129个，ΔPhoP菌株差异蛋白161个，ΔPhoR/P菌株差异蛋白129个。转录组分析NCD-2野生型菌株与突变菌株ΔPhoR、ΔPhoP之间差异表达的基因。结果表明，与野生型菌株相比，在突变体ΔPhoR中共295个基因差异表达;在突变体ΔPhoP中共有212个基因差异表达。对iTRAQ定量蛋白质组和转录组结果进行分析发现PhoR和PhoP主要调控脂肽类抗生素和氨基酸合成、生物膜形成和芽胞形成相关蛋白或基因的表达，并且蛋白质组和转录组结果具有很高的相关性。对差异蛋白进行生物信息学分析，结果表明，PhoR/PhoP双组分系统主要调控由磷酸盐参与的相关合成途径及氨基酸的合成相关途径。在NCD-2菌株中，PhoR/PhoP双组份系统对脂肽类抗生素合成的调控属于间接调控。
5.明确了3个受PhoR/PhoP双组份系统调控基因的功能。
为明确受PhoR/PhoP双组份系统调控的基因citB、abrB和oxdC的生物学功能，利用同源重组技术分别获得了上述基因缺失突变子ΔCitB、ΔAbrB和ΔOxdC。测定了NCD-2菌株和突变子生物膜形成能力和抑菌活性，结果表明ΔCitB突变菌株生物膜形成能力和抑菌活性显著降低，ΔAbrB突变菌株生物膜形成能力和抑菌活性显著提高，ΔOxdC突变菌株的生物膜形成和抑菌活性与野生型菌株没有显著差异。比较了NCD-2野生型菌株及突变菌株分别在Landy培养基、低磷培养基和高磷培养基中脂肽合成能力，结果表明，在低磷培养基中，突变子ΔCitB和ΔOxdC脂肽合成能力明显下降，而突变子ΔAbrB的脂肽合成能力明显增加。在DSM培养基中检测NCD-2野生型菌株和突变菌株的芽胞形成率发现，与野生型菌株相比，ΔAbrB突变菌株芽胞形成率显著提高，而突变菌株ΔOxdC和ΔCitB的芽胞形成率均显著降低。
1.明确了枯草芽胞杆菌NCD-2菌株在棉花根部的定殖特征。
为了解NCD-2菌株的定殖特征，本研究利用穿梭载体pAD123筛选NCD-2菌株中组成型表达的启动子，利用该启动子构建了GFP标记的NCD-2菌株。在共聚焦显微镜下检测GFP标记的NCD-2菌株生物膜形成情况，结果表明，GFP标记的NCD-2菌株可以形成具有三维立体结构的生物膜。共聚焦显微镜下定性观察GFP标记的NCD-2菌株在棉花幼苗根部的定殖，结果表明，NCD-2菌株主要定殖在根尖的伸长区和分生区部位。分别在灭菌土和非灭菌土中通过平板计数法和qPCR分析NCD-2菌株在棉花侧根、主根和根尖上的群体数量。结果表明，平板计数法和qPCR技术显示相似的定殖趋势。在非灭菌土中，NCD-2菌株在根尖的种群数量最多，侧根中定殖数量相对较少而在主根中定殖数量最少。NCD-2菌株在灭菌土中的定殖特征与非灭菌土中基本相似即NCD-2菌株在根尖的种群数量最多，但在接种后21d到35d群体数量有所差异，即NCD-2菌株在主根中的群体数量高于侧根部分。研究表明，NCD-2菌株主要定殖在棉花根部的根尖部位，且在根尖的伸长区和分生区部位更有定殖优势。
2.明确了脂肽类抗生素surfactin和fengycin在NCD-2菌株防治棉花黄萎病中的功能。
分别获得了在NCD-2菌株中丧失surfactin合成能力的突变子ΔSrfAA和同时丧失surfactin和fengycin合成能力的突变子ΔFenC/srfAA。分别比较了NCD-2野生型菌株及突变菌株的溶血活性、群集运动、生物膜形成能力和抑菌活性，在NCD-2菌株中surfactin在溶血活性、群集运动和生物膜形成能力方面发挥主要作用，而fengycin在抑制病原菌生长方面发挥主要作用。比较了野生型菌株NCD-2与突变菌株在棉花根际的定殖能力，结果表明，与野生型菌株相比，突变菌株ΔFenC在棉花根际的种群数量略有减少，而突变菌株ΔSrfAA和ΔFenC/srfAA在棉花根际的种群数量显著降低。RT-qPCR技术检测结果表明，敲除surfactin合成相关基因srfAA或fengycin合成相关基因fenC后降低了生物膜形成相关基因kinC、spo0A、epsA和tasA的表达。检测NCD-2野生型菌株及突变菌株对棉花黄萎病的防治效果，结果表明，surfactin和fengycin在NCD-2菌株防治棉花黄萎病中均发挥重要作用。此外，surfactin和fengycin在溶血活性，群集运动、生物膜形成能力、根际定殖以及生防效果中具有协同增效的作用。表明surfactin和fengycin分别通过提高NCD-2菌株的定殖作用和抑制病原菌生长来达到提高NCD-2菌株生防效果的目的。
3.明确了PhoR/PhoP双组份系统正调控surfactin的合成。
分析了PhoR/PhoP双组份对NCD-2菌株中surfactin合成的影响。在低磷培养基中，同NCD-2野生型菌株相比，ΔPhoR和ΔPhoP突变子的溶血活性、排油能力和生物膜形成能力显著降低，而在高磷培养基中野生型菌株和突变菌株之间差异不显著。通过FPLC色谱分析技术证明NCD-2菌株可以产生surfactin，并发现在低磷条件中，NCD-2野生型菌株所产生的surfactin分别是ΔPhoR和ΔPhoP突变子的2.3和6.4倍。RT-qPCR技术分析表明PhoR和PhoP正调控surfactin的合成，在低磷环境下，ΔPhoR和ΔPhoP突变子中surfactin合成酶基因srfAA的表达量比NCD-2野生型菌株均降低了2.1倍，而在高磷培养基中srfAA基因在ΔPhoR和ΔPhoP突变子中仅降低了0.9倍。构建ΔPhoR和ΔPhoP突变子的互补菌株，该互补菌株均能使突变子的性状恢复到野生型水平。在NCD-2菌株中，PhoR/PhoP双组份系统正调控脂肽类抗生素surfacfin的合成。
4.明确了受PhoR/PhoP双组份系统调控的基因及相关途径。
通过iTRAQ定量蛋白质组学分析技术，比较了NCD-2野生型菌株和突变菌株ΔPhoP、ΔPhoR和ΔPhoR/P的差异蛋白。结果表明，与野生型菌株相比，ΔPhoR菌株差异蛋白129个，ΔPhoP菌株差异蛋白161个，ΔPhoR/P菌株差异蛋白129个。转录组分析NCD-2野生型菌株与突变菌株ΔPhoR、ΔPhoP之间差异表达的基因。结果表明，与野生型菌株相比，在突变体ΔPhoR中共295个基因差异表达;在突变体ΔPhoP中共有212个基因差异表达。对iTRAQ定量蛋白质组和转录组结果进行分析发现PhoR和PhoP主要调控脂肽类抗生素和氨基酸合成、生物膜形成和芽胞形成相关蛋白或基因的表达，并且蛋白质组和转录组结果具有很高的相关性。对差异蛋白进行生物信息学分析，结果表明，PhoR/PhoP双组分系统主要调控由磷酸盐参与的相关合成途径及氨基酸的合成相关途径。在NCD-2菌株中，PhoR/PhoP双组份系统对脂肽类抗生素合成的调控属于间接调控。
5.明确了3个受PhoR/PhoP双组份系统调控基因的功能。
为明确受PhoR/PhoP双组份系统调控的基因citB、abrB和oxdC的生物学功能，利用同源重组技术分别获得了上述基因缺失突变子ΔCitB、ΔAbrB和ΔOxdC。测定了NCD-2菌株和突变子生物膜形成能力和抑菌活性，结果表明ΔCitB突变菌株生物膜形成能力和抑菌活性显著降低，ΔAbrB突变菌株生物膜形成能力和抑菌活性显著提高，ΔOxdC突变菌株的生物膜形成和抑菌活性与野生型菌株没有显著差异。比较了NCD-2野生型菌株及突变菌株分别在Landy培养基、低磷培养基和高磷培养基中脂肽合成能力，结果表明，在低磷培养基中，突变子ΔCitB和ΔOxdC脂肽合成能力明显下降，而突变子ΔAbrB的脂肽合成能力明显增加。在DSM培养基中检测NCD-2野生型菌株和突变菌株的芽胞形成率发现，与野生型菌株相比，ΔAbrB突变菌株芽胞形成率显著提高，而突变菌株ΔOxdC和ΔCitB的芽胞形成率均显著降低。