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丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是生物体信号转导通路的重要组分,主要参与机体细胞增殖、分化和凋亡等生命活动,与应激反应、炎症和肿瘤的发生发展密切相关。MAPK家族成员众多,其中包括细胞外信号调节激酶(ERK)亚家族。弓形虫(T.gondii)内存在两种MAPK分子即TgMAPK1和TgERK7。TgMAPK1与T.gondii速殖子和缓殖子间转换有关;TgERK7分子报道很少,仅限于TgERK7基因构成等方面。为填补TgERK7基因研究空白和探究TgERK7生物学功能,我们从以下几个方面对TgERK7进行了研究。1 pVAX/TgERK7重组质粒的免疫原性分析运用DNAStar 5.0、NCBI/BLAST和Antigen Profiler Peptide Tool等生物学软件对TgERK7氨基酸序列进行系统分析,选择并确定5条候选抗原即3-14 aa,237-249 aa,346-358aa,461-472 aa和647-658 aa。经合成、偶联KLH和多次免疫家兔,成功获得五种效价高、特异性强的多克隆抗体(αA、αB、αC、αD和αE)。通过对Triton X-100通透的T.gondii GT1速殖子荧光染色发现,αA-αE均具有良好的生物学结合能力。本研究成功构建了pVAX/TgERK7真核表达质粒并评价了其免疫原性。经免疫和分析发现,pVAX/TgERK7能刺激BALB/c鼠产生低水平的细胞免疫应答,伴有一定程度的特异性抗T.gondii抗体的产生。攻虫实验结果显示,免疫鼠存活时间分别为10.8±0.2 d(GT1感染)和19.4±1.1 d(PRU感染),与未免疫对照组(pVAX I、PBS和Control)间并无差异(P>0.05)。可见,pVAX/TgERK7质粒对BALB/c鼠无保护效果,尽管可刺激机体产生一定程度的体液和细胞免疫应答。2原核表达TgERK7蛋白及其免疫保护性评价本研究成功克隆并构建了原核表达载体pET/TgERK7,经体外IPTG诱导、SDS-PAGE电泳检测及蛋白纯化与定量等过程,并对TgERK7蛋白的免疫原性进行研究。结果显示,TgERK7蛋白和弗氏佐剂均能刺激BALB/c鼠产生抗体,伴有CD3e+CD4+T淋巴细胞和IFN-γ、TNF-α、IL2等多种因子升高。结果表明,TgERK7蛋白联合弗氏佐剂能够刺激BALB/c鼠产生较强的体液和细胞免疫应答;除抗A肽抗体外,其余抗体均无抗T.gondii特异性,推测可能与弗氏佐剂的使用有关。攻虫感染实验结果显示,TgERK7蛋白和弗氏佐剂联合免疫可显著延长T.gondii GT1速殖子感染BALB/c鼠的急性致死时间(13.8±3.4 d)和降低PRU脑包囊数,但对抵抗T.gondiipru株急性感染作用不明显。结果表明,tgerk7蛋白对balb/c鼠免疫保护性较好。经对比分析tgerk7蛋白和pvax/tgerk7重组质粒所引起balb/c鼠体液和细胞免疫各项指标的变化情况,发现特异性抗体αa在抵抗t.gondiigt1速殖子感染过程中起到不可忽视的重要作用。为验证上述观点,我们使用高浓度的特异性抗t.gondii抗体(αa、αb、αc、αd或αe)胞外处理gt1速殖子,并于不同时间点对其胞内增殖能力进行检测和分析;同设空白对照即未处理组。结果显示,与空白对照相比,经抗体αa处理的速殖子胞内增殖能力显著减弱,且差异程度随检测时间的延长而增大,其余各组间差异均不显著(p>0.05)。结果表明,特异性抗体αa可阻碍t.gondiigt1速殖子侵染宿主细胞。3弓形虫Δtgerk7缺失株的构建与毒力分析为深入探究tgerk7基因的生物学功能,我们运用同源重组原理成功构建了重组体Δerk7-pbluescriptiisk(+),经电转t.gondiigt1速殖子和药物筛选,实现了对tgerk7转座子部分序列的成功替换。经pcr扩增、southernblotting和westernblotting鉴定发现,tgerk7基因部分缺失可导致该基因的完全沉默即最终获得了基因缺失虫株Δtgerk7。毒力实验结果显示,与gt1野生株(10.6±0.3d)相比,Δtgerk7速殖子并不能引起balb/c鼠发生死亡;有趣的是,首次感染35d后再次感染相同剂量的野生株速殖子也不能造成Δtgerk7感染鼠死亡,提示tgerk7蛋白与t.gondiigt1野生株毒力密切相关,可能参与了t.gondii速殖子致病甚至急性致死宿主的病理过程。血清抗体以及腹腔液和血清内细胞因子、no等免疫指标检测结果表明,炎性因子如ifn-γ、mcp-1和il6等的过表达是导致t.gondiigt1速殖子感染鼠急性死亡的主要原因。通过对被感染鼠腹腔中和脾组织内虫子数定量分析发现,感染7d时腹腔内Δtgerk7虫子数极显著降低,而其他各时间点和脾内检虫数均无差异(p>0.05),与细胞因子检测结果基本相符。据此可认为,tgerk7基因是t.gondiigt1速殖子胞内增殖的重要调节因子,与gt1野生株毒力关系密切。4弓形虫tgerk7基因的生物学功能研究为增强实验说服力和提供重要实验参照,以puc19载体为骨架,运用特异性pcr扩增和限制酶多重酶切等分子生物学基本操作方法,成功克隆并构建了补充载体puc/sag1/cat/gra1/sag1/tgerk7/gra1。经多次电转缺失株Δtgerk7虫体和药筛,特异性pcr扩增和westernblotting鉴定以及胞内增殖能力分析,最终获得puc/tgerk7补充株,实现了TgERK7基因在ΔTgERK7缺失虫体内的再表达。T.gondii GT1野生株、ΔTgERK7缺失株和pUC/TgERK7补充株的虫斑大小以及逸出、胞内增殖、入侵、吸附和运动能力等检测和分析结果,结合TgERK7蛋白亚细胞定位结果即位于GT1速殖子顶端,发现TgERK7蛋白是T.gondii GT1速殖子入侵宿主细胞的重要作用因子,参与T.gondii速殖子的入侵过程。5弓形虫TgERK7蛋白结构预测运用PSI-PRED、DISOPRED、MEMSAT-SVM和SWISS-MODEL等蛋白结构预测软件,成功对T.gondii GT1速殖子TgERK7蛋白进行了二级和三级结构预测,并结合TgERK7基因生物学功能,推测了TgERK7蛋白在T.gondii速殖子入侵宿主细胞过程中可能存在的作用方式,即T.gondii速殖子经滑行运动靠近宿主细胞时,TgERK7蛋白因与宿主细胞表面受体结合而被激活,进而引起TgERK7蛋白分子胞内区域发生变构等反应,将接触信息跨膜传进速殖子内,引起速殖子发生一系列变化如蛋白表达、分泌或虫体变型等,为T.gondii侵染宿主细胞提供有利条件。通过评价pVAX/TgERK7重组质粒和TgERK7蛋白免疫原性,同源替换TgERK7转座子部分序列和毒力检测,构建补充株pUC/TgERK7和预测TgERK7蛋白结构等研究,发现TgERK7分子为T.gondii GT1速殖子入侵细胞的重要因子,介导T.gondii速殖子入侵宿主细胞,并提出侵染时可能存在的作用方式,填补了T.gondii ERK7基因生物学功能的研究空白,为日后深入研究TgERK7蛋白作用机制和T.gondii致病机理奠定了基础。后续研究应集中在搜寻TgERK7蛋白作用底物与解析TgERK7蛋白天然构象等方面。