背景:蛋白酶活化受体4(protease-activated receptors 4,PAR4)为G蛋白偶联受体,在血栓形成、炎症反应、血管活性、免疫系统功能、血管增生性疾病等多种病理生理过程中发挥重要作用。近年来的研究发现,对比正常细胞,肿瘤细胞PARs的表达有差异性变化,这些变化与肿瘤的发生和发展以及侵袭转移等恶性生物学行为有着相关联的关系。关于PAR1、PAR2、PAR3的与肿瘤增值、增生、转移、侵袭的相关研究的较多,关于PAR4研究仅表明PAR4在不同的肿瘤组织细胞中的表达,其结果也不尽相同。食管癌是一种常见的恶性程度较高的癌症。近年来,由于生活环境的改善、生活条件的提高,其发病率呈逐年上升趋势。而我国也是食管癌病症的高发区域之一,其发病率和死亡率均位于世界前几位。食管癌的发生、发展是多种因素、多种诱因参与的过程,其发生、发展过程有着致癌基因的激活、抑癌基因的失活等多种改变,查阅相关文献我们了解到PAR4在食管鳞状细胞癌中表达明显低于正常食管鳞状上皮组织,而且PAR4表达程度的高低与食管鳞状细胞癌的分化程度有关,食管鳞状细胞癌的分化程度越高,PAR4的表达程度越高,低分化的食管鳞状细胞癌中PAR4的表达明显减少,甚至无表达。PAR4参与食管鳞状细胞癌发展的过程,但是其中机制尚不清楚,需要进一步研究。表观遗传调控肿瘤细胞增生、增殖是当下众多科研者所想要探究、了解的重要研究之一,表观遗传学是一门关于基因表达的的研究,它是指目的基因的表达的异常在不改变DNA序列的改变的情况下发生的改变。基本上所有的人类恶性肿瘤都存在着表观遗传学的异常变化。而表观遗传的异常表达,可使抑癌基因的表达发生异常,使得恶性肿瘤得以增生、增殖。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC),是一类调控染色体形成和基因表达的关键酶。当组蛋白处于低乙酰化状态时,核小体结构紧密,使各种促进细胞分化和凋亡的基因受到抑制,引起肿瘤的发生。抑制剂通过抑制去乙酰化活性,阻滞肿瘤细胞生长,诱导其分化和凋亡。因此,以为靶点,设计合成抗肿瘤药物具有广阔的前景。组蛋白H3赖氨酸9乙酰化(H3K9 ac),目前相关研究发现这个位点的乙酰化与促进及加强转录因子有关。组蛋白乙醜化修饰异常与肿瘤的发生、发展,早期诊断有着密切的关联,也与癌症的临床预后有关,并且组蛋白去乙酰化抑制剂(HDACI)已被应用于临床治疗某些恶性肿瘤。p16基因是首个研究并被发现与细胞周期调控有关的可以抑制癌细胞生长的基因,正常组织细胞中p16可以抑制CDKs蛋白的活性,能特异性地在G1细胞周期时与cyclin D1竞争结合CDK4/6,使得cyclin D1/CDK4/6复合物的蛋白激酶活性失活或者降低,进而阻止细胞生长周期的前进,限制细胞通过G1/S期而进入S期,使得细周期停止在G1期,从而使细胞的生长受到抑制。p16蛋白表达缺失可出现于多种恶性肿瘤组织中,因此p16基因又称抑制基因,在肿瘤细胞内p16基因出现突变、缺失或启动子区异常甲基化后均可导致p16蛋白的异常表达,出现cyclin D1与CDK4/6结合增加,细胞增殖失控,从而导致肿瘤发生。本次实验研究应用免疫组织化学的方法观察PAR4、HDAC、H3K9ac、p16的表达,通过PAR4激动剂作用于食管癌鳞状细胞,应用Western bolt法观察活化的PAR4对HDAC、H3K9ac、p16的表达影响,从中寻找PAR4与HDAC、H3K9ac、p16之间的相关作用关系,从中发现PAR4在食管鳞状细胞癌发生过程的作用。目的:本研究通过观察食管鳞状细胞癌组织PAR4、HDAC、H3K9ac、p16的表达,通过PAR4激动剂作用于食管癌鳞状细胞,应用Western bolt法观察活化的PAR4对HDAC、H3K9ac、p16的表达影响,从中寻找PAR4与HDAC、H3K9ac、p16之间的相关作用关系,从而为食管癌的发生、发展提供相关新的科学依据。材料与方法:应用免疫组织化学方法观察PAR4、HDAC、H3K9ac、P16在食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织的表达情况。PAR4-AP孵育食管癌鳞状细胞(EC9706)0小时、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时后,应用Western bolt法检测活化后的PAR4对HDAC、H3K9ac、P16表达的影响。PAR4-AP孵育食管癌鳞状细胞6小时后,悬浮于无血清培养液中接种到置于24孔板的Transwell小室中,外加正常含血清培养液培养1天后结晶紫染色,观察活化后的PAR4对食管癌鳞状细胞(EC9706)的迁移能力的影响。PAR4-AP孵育食管癌鳞状细胞6小时后,悬浮于加入含有ECM膜的无血清培养液中接种到置于24孔板的Transwell小室中,外加正常含血清培养液培养1天后结晶紫染色,观察活化后的PAR4对食管癌鳞状细胞(EC9706)的侵袭能力的影响。结果:1.PAR4、HDAC、H3K9ac、P16在食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织的表达,结果分析:显微镜下随机观察5个高倍视野(*400),进行着色打分,评分标准为:不上色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,褐色为3分。染色细胞所占比例打分≤5%为0分,6%-25%为1分,26%-50%为2分,51%-75%为3分,>75%为4分。两者相乘,0分判定为阴性(-),1-4分判定为弱阳性(+),5-8分判定为阳性(++),9-12分判定为强阳性(+++)。将阴性与弱阳性判定为阴性表达,阳性与强阳性判定为阳性表达。(1)PAR4在食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织的表达:应用免疫组织化学法观察,发现PAR4在癌旁组织中的表达情况较食管鳞状细胞癌组织表达水平较高,PAR4染色呈弥漫性贯穿癌旁组织的细胞质和细胞膜,而在食管鳞状细胞癌组织PAR4的表达明显降低,多数细胞无明显表达,只有少数细胞的细胞质和细胞膜染色表达。差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)HDAC在食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织的表达:应用免疫组织化学法观察,发现HDAC在食管鳞状细胞癌组中的表达情况较食管鳞状细胞癌组织表达水平较高,HDAC染色呈弥漫性分布于食管鳞状细胞癌组织的细胞核中,而在癌旁组织HDAC的表达明显降低,多数细胞无明显表达,只有少数细胞的细胞核染色表达。差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)H3K9ac在食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织的表达:应用免疫组织化学法发现H3K9ac在癌旁组织中的表达情况较食管鳞状细胞癌组织表达水平较高,PAR4均匀的染色于癌旁组织的细胞核,而在食管鳞状细胞癌组织PAR4的表达明显降低,多数细胞无明显表达,只有少数细胞的细胞核染色表达。差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)P16在食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织的表达:应用免疫组织化学法发现P16在癌旁组织中的表达情况较食管鳞状细胞癌组织表达水平较高,P16染色于癌旁组织的细胞核,而在食管鳞状细胞癌组织P16的表达明显降低,多数细胞无明显表达,只有少数细胞的细胞核染色表达。差异具有统计学意义(P<0.05)。2.PAR4-AP孵育食管癌鳞状细胞后运用Western boltting技术观察HDAC、H3K9ac、P16的表达变化。(1)PAR4-AP对食管癌鳞状细胞HDAC表达的影响:应用PAR4-AP分时间点0、1、2、6、12、24小时孵育食管癌鳞状细胞后RIPA细胞裂解液提取总蛋白,Western boltting技术观察活化的PAR4对HDAC的表达变化。HDAC在PAR4-AP激动后表达开始降低,于6小时组达到高峰后,活化的PAR4对HDAC的影响开始降低,HDAC表达开始增加,测量蛋白表达的灰度值,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)PAR4-AP对食管癌鳞状细胞H3K9ac表达的影响:应用PAR4-AP分时间点0、1、2、6、12小时孵育食管癌鳞状细胞后RIPA细胞裂解液提取总蛋白,Western boltting技术观察活化的PAR4对H3K9ac的表达变化。观察发现H3K9ac在PAR4-AP后表达开始增加,于6小时组开始增加明显,并呈逐渐增强的趋势,测量蛋白表达的灰度值,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)PAR4-AP对食管癌鳞状细胞P16表达的影响:应用PAR4-AP分时间点0、1、2、6、12、24小时孵育食管癌鳞状细胞后RIPA细胞裂解液提取总蛋白,Western boltting技术观察活化的PAR4对P16的表达变化。P16与PAR4-AP激动后表达开始增加,于1小时组开始增加明显,并呈逐渐增强的趋势,测量蛋白表达的灰度值,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.Transwell法检测PAR4活化对食管癌鳞状细胞迁移能力的影响:PAR4-AP孵育6小时后,悬浮于无血清培养液中接种到置于24孔板的Transwell小室中,外加正常含血清培养液培养1天后结晶紫染色,在400倍显微镜下计数。结果显示PAR4激动组细胞数明显少于对照组,说明PAR4活化可降低食管癌鳞状细胞迁移能力,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.Transwell法检测PAR4活化食管癌鳞状细胞侵袭能力的影响:PAR4-AP孵育6小时后,悬浮于加入含有ECM膜的无血清培养液中接种到置于24孔板的Transwell小室中,外加正常含血清培养液培养1天后结晶紫染色,在400倍显微镜下计数。结果显示,PAR4激动组细胞数明显少于对照组,说明PAR4活化可降低食管癌鳞状细胞侵袭能力,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.PAR4-AP可以降低食管癌鳞状细胞的HDAC的表达,引起H3K9ac的表达增加,引起P16的表达增加。2.活化后的PAR4,可降低食管癌鳞状细胞的迁移、侵袭活性。