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目的:本实验通过探讨含药血清对体外培养早期人膝骨关节炎成纤维样滑膜细胞COX-2mRNA表达的影响,进一步阐释中药复方化瘀祛湿方对早期膝 OA治疗的作用机制,能相应地反映出中药复方化瘀祛湿方的作用靶点,以期为中药复方治疗膝骨关节炎提供可靠的实验理论基础。 方法:选择成年健康新西兰大耳白兔48只,雌雄各半,予编号,按随机数字表法抽取24只分成4组,每组6只:A组(生理盐水组)、B组(补肾活血组)、C组(化瘀祛湿组)、D组(塞来昔布组)。手术切断膝关节前交叉韧带和内侧副韧带建立兔膝 OA退行性变模型。造模成功后4周[1],开始喂药。按人和动物体表面积比计算动物等效给药量,确定每天的剂量。生理盐水对照组灌以等量生理盐水。连续灌胃7天,均按标准饲养环境自然喂养。在最后一次全天药量灌胃90min后,经乌拉坦麻醉后取兔耳缘静脉穿刺采血,4℃过夜,2500r/min离心25min,取血清0.22μm滤膜抽滤、分装,56℃、30min灭活、-20℃保存备用。将收集的早期膝骨关节炎患者滑膜组织(根据Kellgren和Lawrence的X线诊断标准:Ⅰ-Ⅱ级)12例。经分离、纯化滑膜组织,原代成纤维样滑膜细胞培养至四代的成纤维样滑膜细胞(FLS)用于实验,依次分别加入含生理盐水的血清DMEM培养基,含补肾活血方含药血清的DMEM培养基,含化瘀祛湿方含药血清的DMEM培养基,含塞来昔布含药血清的DMEM培养基,连续培养24h[2]。重复离心后,-20℃冻存待测。应用实时荧光定量(RT-PCR)检测四组含药血清干预后的早期膝骨关节炎患者成纤维样滑膜细胞中的COX-2mRNA的表达水平。所得资料应用SPSS18.0统计软件进行统计学分析,以α=0.05作为检验标准。 结果:(1)所有的早期膝骨关节炎患者成纤维样滑膜细胞经不同含药血清干预后均能检测到COX-2mRNA。(2)采用2-ΔΔCt进行相对表达量分析,生理盐水组的COX-2mRNA表达水平最高,与塞来昔布组、化瘀祛湿组及补肾活血组比较有明显差异(P<0.05)。(3)含药血清组间比较:化瘀祛湿组与塞来昔布组两组间的COX-2mRNA表达量比较差异无统计学意义(P>0.05),而以上两组与补肾活血组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。 结论:(1)所有的早期(Ⅰ-Ⅱ级)膝骨关节炎患者成纤维样滑膜细胞经不同含药血清干预后均能降低 COX-2mRNA的表达水平。(2) COX-2mRNA作为早期骨关节炎炎症途径的发生、发展过程中一个可能潜在的启动因子,而早期使用中药复方化瘀祛湿方对早期膝 OA患者成纤维样滑膜细胞中COX-2mRNA的表达具有一定的抑制作用,有望作为防治KOA的有效方法,值得进行更深一步的研究。