背景与目的电子心脏起搏器是目前临床上有效治疗缓慢性心律失常的常规方法，但存在费用昂贵、电池寿命有限、起搏器缺乏对神经激素的自动反应性等不足，且可能出现出血、感染等并发症。近年来，随着对起搏细胞离子通道基因的了解进一步深入，利用生物学及其相关技术，对受损的心脏起搏点进行修复或替代，重建心脏“生物起搏点”，使心脏的起搏和传导功能得以恢复，已成为当前心脏电生理学界研究的热点。起搏电流(current funny，If)是窦房结细胞舒张期自动除极化的主要决定因素，并在心率控制及神经递质对心率的调节中起重要作用；超极化激活的环化核苷酸门控(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated, HCN)通道基因家族编码的HCN通道则是If形成的分子基础。目前已有利用HCN基因修饰的间充质干细胞(Mesenchymalstem cells, MSCs)移植进入房室传导阻滞的动物模型中成功创建生物起搏点的报道，结果令人鼓舞，但有一些关键的问题仍亟待解决。首先，在体研究发现生物起搏的频率低下(约40~50bpm，也有低至30bpm的情况)，显著低于与体外心肌细胞共培养时的起搏频率，是否起搏电流的特性发生了改变？具体原因尚不清楚；其次，MSCs具有多向分化的潜能，其移植到宿主心脏后，仅作为一个载体工具，还是分化为具备功能的心肌样细胞发挥起搏作用？以上问题对于移植细胞能否在体内稳定、持久的发挥起搏功能至关重要。然而，由于缺乏对移植细胞直接进行原位功能检测的手段，目前多数研究主要是通过免疫组织化学检测移植细胞的表型变化，以及通过宏观的心电图、三维电解剖标测系统(CARTO)等无创检查对移植细胞的起搏功能进行评估。但移植细胞表型的改变并不等同于具备了心肌细胞样的功能；无创检查的空间分辨力有限，不能对“体内干细胞和心肌细胞如何交互作用影响心脏功能”进行精确描述。因此，目前的研究尚不能真正阐明移植细胞在宿主心脏中发挥起搏功能及起搏功能发生改变的机制。众所周知，起搏电流(funny current, If)是起搏细胞发挥功能的基础，而膜片钳技术是检测细胞膜离子通道电流的最根本、有效的方法。利用膜片钳技术针对移植细胞进行原位的电生理学研究，将有助于阐明起搏细胞的电生理学特性及其与宿主心肌细胞交互作用的机制。对移植细胞进行原位膜片钳检测需要在组织切片上进行，但目前尚未发现利用成年动物心肌组织切片膜片钳技术原位检测移植干细胞电生理特性及其与宿主心肌细胞交互作用功能的报道。本实验拟利用组织片膜片钳技术，对同种异体移植到宿主心脏中的mHCN4基因修饰的大鼠MSCs(HCN4-MSCs)进行原位电生理学研究。方法1.取健康SD大鼠骨髓，经密度梯度离心和贴壁培养获得MSCs，在体外扩增、纯化。2.构建mHCN4的表达载体pLenti6.3-mHCN4-IRES2-EGFP(LV-HCN4-EGFP)及空载体pLenti6.3-IRES2-EGFP(LV-EGFP)，分别转染第三代的MSCs，5~7天后利用免疫组化方法及膜片钳方法检测起搏离子通道蛋白及电流的表达。3.将MSCs同种移植到SD大鼠心脏中创建细胞移植模型，在此基础上建立适合于膜片钳检测的心肌组织切片方法。4.将SD大鼠分为两组(每组各10只)：1)实验组移植转染mHCN4的MSCs(HCN4-MSCs)；2)体内对照组移植仅转染EGFP的MSCs。各组大鼠在细胞移植4周后处死，取心脏进行切片，对移植细胞进行原位的膜片钳检测。同时，另设两个组作为体外对照：1)HCN4-MSCs体外培养1周组，2)HCN4-MSCs体外培养4周组。在本研究中，上述4组分别被定义如下：实验组，体内对照组，体外对照组(1)及体外对照组(2)。利用膜片钳技术对各组细胞的起搏电流(If)进行检测，并对各组细胞记录到的If电流特性进行比较和分析。并检测实验组及体内对照组移植细胞的动作电位、钠电流及钙电流。5.在全细胞膜片钳封接的基础上，结合荧光黄染料转运的实验方法，检测移植细胞与宿主心肌细胞之间的缝隙连接通讯功能。6.膜片钳检测结束后，将心肌组织用4%多聚甲醛常规固定、石蜡包埋、切片，利用免疫荧光方法检测移植细胞HCN4及EGFP蛋白的表达；利用免疫组化的方法检测缝隙连接蛋白43(connexin43, CX43)的表达及分布，以及移植区域IgG的表达及CD3~+T细胞的浸润。结果1.本实验分离纯化的MSCs高表达CD29和CD44抗原(高达99%以上)，而CD34和CD45抗原表达与同型对照没有显著差异；并且在特定的诱导条件下，MSCs可以分化为心肌样细胞、成骨细胞及脂肪细胞，证实其多向分化潜能。以上特性符合目前公认的MSCs标准。2.在MOI=10的条件下，慢病毒对MSCs的转染效率可以达到67.0±6.6%(n=5)，MSCs形态及活性未受明显影响。转染“pLenti6.3-mHCN4-IRES2-EGFP”的MSCs同时表达EGFP及mHCN4蛋白，并记录到可被4mM CsCl可逆性阻断的超极化激活的内向电流，证实为起搏电流If；而转染“pLenti6.3-IRES2-EGFP”的MSCs仅表达EGFP，未记录到起搏电流If。3.通过改良的心肌组织切片方法，获得了活性良好、背景荧光低的心肌组织切片。在切片中，心肌细胞结构完整、横纹清晰可见；移植的MSCs呈簇状分布在心肌细胞的缝隙之间，细胞呈类圆形、短梭形，形态完整、表面光滑，与心肌细胞紧密连接。在荧光条件下，心肌组织自发荧光背景较低，可以观察到EGFP标记的MSCs。通过全细胞膜片钳方式，分别记录到了组织片中心肌细胞及移植的MSCs细胞的膜电流，证实细胞活性良好，完全能够满足针对移植MSCs进行原位膜片钳检测的需要。4.实验组移植的HCN4-MSCs在宿主心脏中能存活4周以上。实验组与体外对照组(1)及体外对照组(2)的HCN4-MSCs表达超极化激活的起搏电流(If)。体内对照组的MSCs不表达If。(1)实验组与体外对照组(1)及体外对照组(2)相比，三组间If电流幅值无显著差异[分别为-1007.4±132.3pA (n=14)、-1012.5±187.3pA (n=16)及-1025.5±200.9pA (n=15)，P>0.05]。三组间细胞膜电容比较有显著性差异(P值均<0.05)，其中实验组(6.8±1.2pF， n=14)<体外对照组(1)(25.0±5.6pF,n=16)<体外对照组(2)(32.4±4.8pF，n=15)。三组间电流密度分别为-151.7±26.1pA/pF (n=14)，-41.6±7.7pA/pF (n=16)及-31.7±4.0pA/pF (n=15)，差异亦达显著性(P值均<0.05)。(2)实验组If电流的激活阈电位为-46.7±5.9mV(n=20)，明显低于体外对照组(1)(-40.6±4.4mV，n=20)及体外对照组(2)(-41.3±5.2mV，n=22)，P值均<0.05；而两个体外对照组之间无显著差异(P=0.181)。(3)与体外对照组(1)及体外对照组（2）If电流的半激活电压[分别为-94.8±7.8mV, n=16；-96.4±6.6mV, n=15]相比，实验组If电流的半激活电压(-107.8±14.6mV,n=14)分别负移了大约13mV及11mV，差异达到显著性(P值均<0.05)。而两个体外对照组之间无显著差异(P=0.553)。(4)实验组的If电流激活曲线的斜率为-13.7±1.7(n=14)，与体外对照组(1)(-11.5±1.8,n=16)及体外对照组(2)(-11.2±2.2,n=15)相比，均达到显著差异(P值均<0.05)，而两个体外对照组之间无显著差异(P=0.717)。(5)在指令电压为-140mV时，实验组If电流的激活时间常数为509.8±66.6ms(n=6)，与体外对照组(1)(405.6±64.5ms， n=8)及体外对照组(2)(427.5±62.2ms，n=7)相比，有更缓慢激活的趋势，但三组之间的差异未达显著性(P=0.051)。(6)三组If电流的翻转电位分别为实验组-32.3±3.3(n=8)，体外对照组(1)-29.5±3.9(n=11)，体外对照组(2)-30.9±3.0(n=10)，三者之间无统计学差异(P>0.05)。(7)3μM异丙肾上腺素能够使实验组If电流激活曲线的半激活电压正移约9.7mV(从-106.5±9.5mV到-96.8±8.7mV, n=4; P<0.05)，但对激活曲线的斜率影响不明显(从-12.8±2.1到-12.9±1.8，n=4; P>0.05)。5.在实验组、体内对照组及两个体外对照组中，均未能在MSCs上记录到去极化激活的内向INa或ICa-L电流，亦未能记录到动作电位。在膜片钳全细胞记录模式的基础上进行的荧光染料转运实验中，未发现荧光素黄染料从被检测的HCN4-MSCs(n=6)扩散到周围的心肌细胞中。6.免疫组化检测结果显示，只有极少数的移植HCN4-MSCs表达CX43，且CX43以点状的模式随意分布于细胞的接触界面上，与心肌细胞的CX43分布(局限在闰盘)显著不同。移植区域未见IgG的表达及CD3+T细胞的浸润。结论1.本实验建立了一种能够满足膜片钳检测需要的心肌组织切片方法，并在此基础上成功对移植到宿主心肌组织中的起搏细胞进行了原位的电生理学研究。2. mHCN4基因修饰的大鼠MSCs(HCN4-MSCs)同种移植到宿主心脏中能存活4周以上，并持续表达超极化激活的起搏电流(If)。体内对照组的MSCs(MSCs-EGFP)不表达If。3.移植的HCN4-MSCs表达的If电流幅值与体外对照组相似，但膜电容及电流密度与体外对照组细胞有显著差异。与体外对照组的细胞相比，移植的HCN4-MSCs的If电流激活阈电位及半激活电压显著负移(差异达显著性)，激活曲线斜率增大(差异达显著性)，激活时间常数延长(但差异未达显著性)，翻转电位无显著差异。4.移植后4周，HCN4-MSCs及MSCs-EGFP均不表达去极化激活的内向钠电流及钙电流，未记录到动作电位。MSCs与宿主心肌细胞形成缝隙连接耦合的比率低下。5.移植后4周，在MSCs的移植区域，未观察到体液免疫排斥及细胞免疫排斥现象。