论文部分内容阅读
2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）是一种内吸性苯氧羧酸类除草剂,广泛应用于小麦、水稻、玉米、甘蔗作物田中防除藜、苋等一年生和多年生阔叶杂草以及萌芽期的禾本科杂草。由于其用量大,长期使用对水体、土壤等生态环境造成了严重的残留污染,对农产品安全和人类健康构成潜在的威胁,利用微生物修复来降低生态环境中除草剂的残留污染已引起科学工作者的广泛关注。本文以土壤中分离筛选到的2,4-D降解菌为研究对象,开展降解菌的分类地位鉴定、2,4-D降解特性与其降解途径研究,初步探讨了该降解菌菌剂制备方法。主要研究结果如下:1.从受2,4-D等除草剂污染的大豆田土壤中分离到一株能利用2,4-D作为唯一碳源和能源生长的菌株T1,根据其形态学、生理生化特征、16S rDNA序列同源性分析将其鉴定为吉氏贪铜菌（Cupriavidus gilardii）。2.吉氏贪铜菌（C.gilardii）在LB培养基中适宜生长温度为30℃,pH为8.0。吉氏贪铜菌（C.gilardii）对2,4-D的降解主要受2,4-D初始浓度、温度、pH和初始接菌量等因素的影响。在初始接菌量为0.5 mL（OD600=0.6）,温度为30℃,pH为7.0的无机盐培养液中,10.0、50.0和100.0 mg?L-1 2,4-D的降解半衰期分别为9.3 h、12.8h和23.5 h;在接菌量为0.5 mL（OD600=0.6）,pH为7.0条件下,培养温度分别为20℃、25℃、30℃、37℃、42℃时,培养10 h后50.0 mg?L-1 2,4-D降解率分别为17.0%、26.6%、49.0%、45.9%、1.8%;在温度为30℃,pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0时,培养24 h后50.0 mg?L-1 2,4-D的降解率分别为96.3%、97.9%、98.9%、95.8%、83.5%;在温度为30℃、pH为7.0条件下,初始接菌量分别为0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL（OD600=0.6）时,培养8 h后,50.0 mg?L-1 2,4-D的降解率分别为7.2%、11.9%、14.4%、48.9%、100.0%。这些结果表明吉氏贪铜菌（C.gilardii）降解2,4-D的适宜温度为30-37℃,pH值在5.0-8.0范围内具有良好的降解效果,并且2,4-D的降解率随初始接菌量的增加而显著增大。3.吉氏贪铜菌（C.gilardii）对其它除草剂的降解谱测定表明,以2甲4氯、2,4-D钠盐、2甲4氯异辛酯为唯一碳源时,3种除草剂初始浓度均为50.0 mg?L-1时,培养7 d后,其降解率依次为99.7%、100.0%、37.4%;但对2,4-D丁酸、2,4-D丙酸、2,4,6-三氯苯酚、2,4-D异辛酯无降解作用。4.利用GC-MS/MS和UPLC-MS/MS初步探讨了吉氏贪铜菌（C.gilardii）降解2,4-D可能的途径。研究发现吉氏贪铜菌（C.gilardii）降解代谢2,4-D可能途径为:2,4-D首先脱去苯环侧链上苯氧乙酸的乙酸,形成2,4-二氯苯酚（2,4-DCP）,然后2,4-DCP的苯环上羟基的邻位羟基化生成3,5-二氯儿茶酚（3,5-DCC）。吉氏贪铜菌（C.gilardii）对10.0 mg?L-12,4-二氯苯酚（2,4-DCP）和10.0 mg?L-13,5-二氯儿茶酚（3,5-DCC）分别培养6 h和16 h后降解完全,说明2,4-D的代谢中间产物不会累积。5.选择海藻酸钠为包埋剂,CaCl2为固定剂,以CaCl2浓度、海藻酸钠浓度、湿菌体量和固定化时间为影响因素设计4因素3水平正交实验,制备吉氏贪铜菌（C.gilardii）的降解菌剂。结果表明,最佳固定化条件为湿菌体量3.0 g、CaCl2浓度为1%、海藻酸钠浓度为4%、钙化时间8 h。