【摘 要】
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目的:B细胞由骨髓中造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSCs）发育,经共同淋巴祖细胞（Common lymphoid progenitor,CLPs）分化而来,成熟B细胞通过分泌抗体参与体液免疫调节,维持机体稳态。HEM1（Hematopoietic protein 1,HEM1）蛋白是WAVE2复合体的重要组成成员,其属于Nck相关蛋白并与激活的Rac相互作用调节细
【基金项目】
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国家自然科学基金（82073484）； 国家自然科学基金（81860026）,“HEM1在胎肝造血干细胞迁移定居骨髓的作用及机制”,2019.01-2022.12； 国家自然科学基金（81960104）,“交感神经递质在化疗肠道干细胞损伤中的保护作用及机制”,2020.01-2023.12； 江西
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目的:B细胞由骨髓中造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSCs）发育,经共同淋巴祖细胞（Common lymphoid progenitor,CLPs）分化而来,成熟B细胞通过分泌抗体参与体液免疫调节,维持机体稳态。HEM1（Hematopoietic protein 1,HEM1）蛋白是WAVE2复合体的重要组成成员,其属于Nck相关蛋白并与激活的Rac相互作用调节细胞运动。在我们的前期研究工作中,发现全身敲除HEM1蛋白能显著降低骨髓B220+B细胞数,提示HEM1蛋白也许在B细胞发育中起一定作用。本研究利用Cre-lox P系统探索在生理及病理条件下,特异性敲除B细胞内的HEM1蛋白,以研究HEM1蛋白在B细胞发育和再生中的作用及机制。方法:利用Cre-lox P重组酶系统产生B细胞内特异性敲除HEM1小鼠即HEM1f/f,CD19-Cre+（CKO）小鼠,HEM1+/+,CD19-Cre+（WT）小鼠为对照,实验中用的小鼠遗传背景均为C57BL/6遗传背景。采用流式细胞术分析生理条件下6-8周龄小鼠骨髓、脾脏、淋巴结、外周血等器官中的B220+细胞、前祖B细胞（Pre-pro-B cell,CD24-CD43+）、祖B细胞(pro-B cell,CD24intCD43+)、前B细胞(pre-B cell,CD24hiCD43-)、非成熟B细胞（immature B cell,Ig D-Ig M+）、成熟B细胞（mature B cell,Ig D+Ig M+）、边缘性B细胞(MZB,B220+CD21/35hiCD23-)和滤泡性B细胞(FOB,B220+CD21/35intCD23hi)等B细胞比例和数量;通过6.0 Gy X-射线全身辐射6-8周龄小鼠1个月后,分析WT和CKO小鼠骨髓、脾脏、淋巴结、外周血等器官B细胞比例和细胞数。结合流式细胞术检测骨髓成熟B细胞和脾脏MZB、FOB细胞的增殖和凋亡情况。通过流式分选出骨髓成熟B细胞,结合RNA-Seq测序分析,探索HEM1在小鼠B细胞发育中的作用机制。结果:1.与WT小鼠相比,CKO小鼠骨髓中CD19+阳性细胞内HEM1表达明显降低（P＜0.05）。2.生理条件下,与WT小鼠相比,CKO小鼠骨髓内成熟B细胞比例和数量显著下降（P＜0.001）;脾脏中MZB和FOB的数量及比例显著减少（P＜0.01）。3.6Gy X-射线辐射后30天,与WT小鼠相比,CKO小鼠骨髓内成熟B细胞的比例和数量尚未恢复（P＜0.01）,脾脏MZB和FOB的比例均显著减少（P＜0.01）。4.细胞周期实验结果表明,与WT小鼠相比,CKO小鼠中骨髓成熟B细胞G0期细胞比例明显降低（P＜0.05）。5.凋亡实验结果表明,与WT小鼠相比,CKO小鼠中骨髓成熟B细胞及脾脏MZB、FOB细胞的凋亡比例无明显统计学意义。6.分析WT和CKO小鼠骨髓成熟B细胞的RNA-Seq数据,在CKO小鼠骨髓mature B细胞内有130个基因表达上调,132个基因表达下调。在下调的基因中,有与B细胞功能密切相关的基因,如Xlr3a、CD19和Gabbr1等。通过QRT-PCR进一步验证了这些基因在CKO小鼠mature B细胞内的表达显著低于WT小鼠。结论:1.生理条件下,特异性敲除CD19+B细胞内的HEM1基因显著降低骨髓内mature B细胞比例和数量。2.电离辐射后,CD19+B细胞特异性缺失HEM1明显减缓了B细胞的恢复。3.特异性敲除B细胞内的HEM1基因,导致B细胞数量和比例明显减少可能与细胞增殖有关,但与细胞凋亡无关。4.特异性敲除B细胞内的HEM1基因,导致与B细胞发育的相关基因表达下调。
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