原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是世界范围内最常见的肿瘤之一,有着发病隐匿、病情进展快、术后复发转移率高以及预后不良的特点。导致原发性肝细胞肝癌预后不良的因素中,易于成血管性是其中最重要的一个,使肿瘤更容易扩散,向邻近脏器浸润和远处脏器的转移。血管内皮生长因子(VEGF)在肝癌研究中较早受到广泛关注：增加血管通透性及促进血管生成。VEGF信号传导通路包含：3种属于酪氨酸蛋白激酶受体(RTK)型,为flt-1(VEGFR-11)、KDR/flk-1(VEGFR-2)和flt-4(VEGFR-3),另2种是非酪氨酸蛋白激酶受体型,分别是神经纤维因子l(Neuropilin1,NP-1)和神经纤维因子2(Neuropilin-2,NP-2),最初被确认为神经细胞SEMA3亚家族的受体。NP-1和NP-2(有相似的结构,约47%氨基酸序列同源)是VEGF165共同受体,可以增强VEGF165和VEGFR-2相互作用。在几项研究中发现：NP-1上调在体内试验证实与前列腺癌的侵袭性相关,体外试验可增加结肠癌和胰腺癌血管生成。Berge M等发现,人类肝细胞肿瘤NP-1的高表达与原发性肝癌的显著相关,可以促进肿瘤血管和细胞生长,加快肿瘤进展。SEMA家族最初发现是在神经轴突导向中发挥作用。最近研究发现SEMA家族可与VEGF165竞争NP-1受体抑制血管生成。SEMA-3B定位于染色体3p21.3区域,该区域的等位基因缺失或启动子甲基化突变与肺癌和乳腺癌的早期发病密切相关,其在肿瘤发生发展机制中的作用才引起了人们的广泛关注。因此SEMA-3B被确定为候选肿瘤抑制基因。据报道SEMA-3B和VEGF165之间的平衡可以导致乳腺癌肿瘤进展。SEMA-3B、VEGF及其共同受体Neuropilin-1在原发性肝细胞肝癌中的表达情况未见文献报道。目的：通过检测SEMA-3B、VEGF、NP-1蛋白和微血管密度(MVD)在肝细胞癌中表达情况,计算VEGF和SEMA-3B染色评分获得VEGF/SEMA-3B比率,分析这些指标与原发性肝细胞肝癌患者临床病理指标的关系,并分析能否成为评价患者预后的重要指标。资料与方法1、临床标本与病理资料：2005年7月至2010年12月山东大学齐鲁医院普外科收治的原发性肝细胞肝癌患者73例,术前经CT、MRI等资料证实为肝癌,未见其他器官肿瘤病变,术后病理诊断为肝细胞癌。病人一般情况良好,肝功能正常,按肝功能分级(Child分级)属于A级；或属于B级,经保肝等综合治疗后,肝功能恢复到A级。手术切除原发性肝细胞肝癌癌组织和癌旁组织,一期接受根治性肝癌切除；14例正常肝组织作为对照。所有标本均经两名高年资病理科医生检查,手术切缘均未查见肿瘤残留。所有原发性肝细胞肝癌患者术前均未行射频微波消融、无水酒精注射、放疗或肝动脉化疗栓塞术(TACE)等特殊治疗方法。样本中男性57例,女性16例,年龄32-73岁,中位年龄56岁。所有标本离体后均立即切开取材,一部分组织放于液氮中冷冻保存备用,另一部分放于福尔马林溶液中固定进行石蜡包埋切片。2、免疫组化：SEMA-3B多克隆抗体、VEGF兔抗人多克隆抗体及NP-1兔抗人多克隆抗体(ABCAM,英国)1：200稀释。步骤按照通用二抗试剂盒说明书(GeneTex,美国)进行。鼠抗人CD34单克隆抗体(SANTA,美国)1：200稀释。VEGF及NP-1实验步骤同上。Western Blotting检测到的高表达SEMA-3B肝癌标本为阳性对照,CD34的阳性对照用正常肝组织血管；PBS缓冲液替代一抗作为阴性对照。SEMA-3B、VEGF及NP-1阳性以胞浆和(或)胞膜内出现棕黄色颗粒为标准。应用半定量积分法,进行阳性细胞计数,每张切片随机选取5个视野,计数500个细胞；染色强度评分标准：不着色为0分,黄色为1分,棕黄色为2分,黄褐色为3分。染色评分为阳性细胞比率与染色强度的乘积,范围是0-300,0-40者为阴性,40-300者为阳性。VEGF/SEMA-3B结果：0-3为低表达,>3为高表达。MVD计数方法：在100倍光镜下观察下,选取肿瘤组织内5个微血管高度密集区域,然后在200倍光镜(0.708mmm2)下计数视野内微血管数。再计算5个区域的MVD平均值。在肿瘤区域每个染成棕黄色的单个细胞或细胞簇、有或无完整管腔结构作为一个血管计数。2名高年资的病理科医生对病理结果进行核查。3. Western blotting用研磨棒将200mg组织研碎,加入0.6ml细胞裂解液(北京碧云天公司)30分钟,然后在12000rpm4℃离心10分钟,取上清液。根据蛋白浓度定量试剂盒(北京碧云天公司)测量蛋白浓度。蛋白100℃变性5min。取50μg总蛋白,以10%聚丙酰胺凝胶电泳后,用湿转法将蛋白转移到PVDF膜,TBST配置5%脱脂奶粉封闭1小时。将PVDF膜置入1：5000稀释的兔抗人SEMA-3B多克隆抗体(ABCAM,英国)中,4℃孵育过夜。第二天TBST洗膜10分钟*3次后放入1：2000稀释的羊抗兔二抗(北京碧云天公司)室温1.5小时。应用TBST洗膜10分钟*3次。用ECL发光试剂盒(MILLIPORE,美国)进行显影曝光。4、统计学处理Chi-square检验用于分析SEMA-3B、VEGF和NP-1与其相应临床病理指标和MVD之间的相关性。Spearman等级相关用于验证指标之间的相关性。Kaplan-Meier方法用于绘制生存曲线图,Log-rank检验用于分析SEMA-3B、VEGF和NP-1与肝癌患者无瘤生存时间的关系,Cox回归用于多因素生存分析。使用统计学软件SPSS13.0进行分析,P<0.05表示有显著差异,有统计学意义。结果1、肝细胞肝癌中SEMA-3B、VEGF和NP-1的表达情况1.1. SEMA-3B的表达情况SEMA-3B蛋白定位于细胞的胞浆中。免疫组织化学实验结果显示：肝细胞癌组织SEMA-3B的阳性率为42.4%,低于癌旁组织及正常肝组织,癌旁组织阳性率为84.9%,正常肝组织阳性率为78.6%,P值均小于0.05,有显著差异。Western blotting显示SEMA-3B的表达量肝癌组织中低于癌旁肝组织中的表达量,与免疫组化的实验结果一致。将肝细胞肝癌中SEMA-3B蛋白的表达与临床病理特征进行统计学分析,结果发现：SEMA-3B阴性组与肿瘤大小、肿瘤有无血管侵犯、有无卫星灶及以及病理学分级密切相关(p<0.05)。1.2、VEGF的表达情况VEGF染色定位于细胞的胞浆内,肿瘤组织中阳性细胞以弥漫性分布为主。实验结果显示：VEGF肝细胞癌组织、癌旁组织中的检出率分别为72.6%、25.1%,P值小于0.05,有显著的统计学差异。正常肝脏组织中未检测出VEGF。研究VEGF在HCC中表达与HCC临床病理特征的关系：VEGF阳性组与肿瘤的体积(最大肿瘤直径)、病理学分级密切相关(p<0.05)。1.3、NP-1的表达情况在肝细胞肝癌组织中,NP-1染色定位于癌细胞胞膜上和胞浆内,阳性表达弥漫分布于整个胞浆或沿胞膜周边呈线状分布,在癌旁组织中少量表达,正常肝细胞内呈阴性表达。实验结果显示：肝细胞癌组织、癌旁组织NP-1的阳性率分别为63.0%、4.1%,P值均小于0.05,有显著的统计学差异。研究VEGF在HCC中表达与HCC临床病理特征的关系：NP-1阳性组与肿瘤的体积(最大肿瘤直径)、肿瘤卫星灶、病理学分级密切相关(p<0.05)。2、SEMA-3B、VEGF、NP-1与MVD表达的相关性在本实验中,高倍镜(200×)视野下MVD(微血管密度)中位数值为92,定义MVD值高表达为>92,低表达为≤92。其中MVD高表达组计数为112±7.5,MVD低表达组为85.1±4.4。SEMA-3B、VEGF、NP-1与MVD表达的相关性分析：SEMA-3B阴性组中的MVD值明显高于SEMA-3B阳性组中的MVD值,P值为0.003,差异具有统计学意义,SEMA-3B与MVD呈负相关关系；VEGF阳性组中的MVD值明显高于VEGF阴性组中的MVD值,P值为0.021,差异具有统计学意义,VEGF与MVD呈正相关关系；NP1阳性组中的MVD值明显高于NP-1阴性组中的MVD值,P值为0.021,差异具有统计学意义；SEMA-3B表达与VEGF、NP1显示为负相关关系,P值分别为<0.001、0.009,差异具有统计学意义；VEGF与NP-1显示为轻微正相关关系,但差异不具有统计学意义。3、生存分析对所有肝癌病人进行了回顾性生存(3年无瘤生存期)分析。并将其与SEMA-3B、VEGF、NP-1及VEGF/SEMA-3B进行统计学分析。结果显示：单因素分析结果显示SEMA-3B阳性组患者明显好于SEMA-3B阴性组患者(阳性：48.4%,阴性：35.7%；P：0.225),但差异不具有统计学意义；NP-1阳性组与阴性组患者3年无瘤生存期的差异不具有统计学意义。VEGF阳性组患者3年无瘤生存期低于VEGF阴性组患者(阳性：35.1%,阴性：65.0%；P：0.011),差异具有统计学意义；VEGF/SEMA-3B比率高的患者3年无瘤生存期明显低于VEGF/SEMA-3B比率低的患者(高：28.6%,低：66.7%；P=0.002),差异具有统计学意义。多因素分析VEGF/SEMA-3B比率可以作为预测原发性肝细胞肝癌术后复发的一个独立指标(p=0.031)。结论：在原发性肝细胞肝癌中SEMA3B蛋白低表达、VEGF高表达及NP-1高表达与肿瘤发展、血管形成密切相关,高VEGF/SEMA-3B比率可作为预示原发性肝癌易于复发的一个指标。