胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，在所有肿瘤中，发病率居世界第四位，死亡率为世界第二位。尽管全球范围内胃癌发病率有所下降，但是在亚洲国家其发病率仍然较高。尽管治疗策略在不断改进，比如，化疗已经作为辅助治疗手段应用于提高治疗手术切除率或用于延长不可切除胃癌患者的生存率。但其预后仍然不理想，5年生存率不到30％。现在认为，遗传、生活习惯、幽门螺杆菌感染等都会导致胃癌的发生。多种关键分子或信号通路的改变可能通过影响胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭促进胃癌的发生发展。　　膜联蛋白家族属于Ca（2+)调节的磷脂和膜结合蛋白。Annexins超家族是一类结构相关钙依赖的磷脂结合蛋白超家族，一种细胞溶质蛋白，广泛存在于各种组织细胞中，且含量较高，约占细胞总蛋白质的2％以上。Annexins以可溶形式和以通过与细胞骨架组成蛋白或调控细胞与细胞外基质相互作用蛋白的稳定结合或可逆结合的形式存在。目前可以分为A、B、C、D、E5组。A组主要存在于高等脊椎动物中，人类的组织器官中目前已有13个成员，其中就包括annexin A3。脊椎（哺乳）动物的膜联蛋白属于A类.自上世纪70年代末发现第一个膜联蛋白至今，在脊椎（哺乳）类生物中已发现了12个家族成员。它们在结构上具有相似性，其高度保守的C末端，由70～80个氨基酸构成4个重复序列;同时，N端氨基酸的长度及序列各不相同，与其各异的功能相关。B组主要存在于无脊椎动物中;C组主要存在于真菌和部分单细胞真核生物中;D组主要存在于植物中，E组主要存在于原核生物中。该家族成员在结构上高度相似，都具有(1) C-末端的保守结构，由4个同源重复序列组成，每个由70个氨基酸残基组成的重复序列，为高度α螺旋结构;称为中心结构域(core domain)，可通过以钙离子依赖的方式可逆地和细胞膜磷脂结合;各种annexins蛋白的中心结构域大约有(40％～60％)的氨基酸序列同源;(2)特异可变的N端结构域，由20～200个氨基酸残基组成，不同的膜联蛋白中N端序列及长度各不相同，主要发挥调节膜联蛋白与配体的相互作用和与膜结合的作用，N末端变化是决定每种蛋白的不同的生物学功能而且每种annexins蛋白在机体的不同组织和部位也执行着不同的生物学功能。膜联蛋白A3(annexin A3，ANXA3)，是在此家族中既往研究比较少的一个蛋白。在细胞分化和细胞迁移以及免疫调节、骨形成、钙化等多方面中均有一定作用。家族成员膜联蛋白A3(Annexin A3)在肿瘤的发展、转移和耐药形成过程中都扮演重要角色。近几年来ANXA3在肿瘤相关研究方面逐渐成为热点，已经有证据表明。它在肿瘤依赖的自身免疫调节方面有一定特殊作用，而且越来越多种类的肿瘤研究表明，它可能会是一个很好的耐药相关或肿瘤预后提示的标记物。然而，Annexin A3在不同肿瘤具有不同的作用，可能是肿瘤抑制因子，也可能是肿瘤促进因子，这依赖于肿瘤细胞和组织中的类型。因此，Annexin A3可以作为肿瘤治疗的靶标以及肿瘤发展、浸润和转移以及肿瘤患者的预后的生物标志。然而，Annexin A3在胃癌中的表达和功能仍不清楚。　　nnexins是一组多基因家族钙调节磷脂结合蛋白，某些annexins的表达水平的改变和活性改变以及定位的改变可以导致人类多种疾病的发生，并可导致膜联蛋白病。Annexins作为一类钙依赖性磷脂结合蛋白，在细胞信号转导过程中有很重要作用，目前对其性质结构等方面有了一些了解，但并不全面，在以后的研究中有待进一步研究拓展，特别是在细胞增殖和凋亡，肿瘤的发生、浸润和侵袭等过程中的生物学作用机制。　　因此，本研究以临床切除的胃癌组织及体外培养的胃癌细胞系为研究对象，通过实时定量RT-PCR、免疫印迹等方法观察Annexin A3在不同分化程度的胃癌及体外培养的胃癌细胞株中的表达，通过封闭Annexin A3表达，运用实时定量RT-PCR、免疫印迹、流式细胞术、细胞黏附、迁移等技术研究Annexin A3对胃癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响，以阐明Annexin A3在胃癌发生发展过程中的重要作用。　　第一部分、Annexin A3在胃癌组织及胃癌细胞株表达及意义　　目的:观察Annexin A3在临床切除的不同分化程度胃癌标本和不同分化的胃癌细胞株中的表达情况。　　方法:主要利用荧光定量RT-PCR、Western blot及免疫组织化学染色等方法观察Annexin A3在临床切除的不同分化程度胃癌标本和不同分化的胃癌细胞株中的表达情况。　　结果:　　1.Annexin A3在胃癌组织和癌旁组织中的表达差异应用RT-PCR及Western blot方法检测了所有临床切除的胃癌样本及癌旁对照组织中Annexin A3的表达。结果显示，与癌旁组织相比，胃癌组织中Annexin A3的mRNA和蛋白表达水平均明显升高。而免疫组织化学染色也证实了这一结果，胃癌组织中阳性棕色颗粒较癌旁对照组织颜色较深、数量较多。以上结果均表明Annexin A3在胃癌发生过程中发挥了重要作用。　　2.Annexin A3表达与胃癌分化程度的相关性为了进一步明确Annexin A3与胃癌发生的关系，我们进一步观察了Annexin A3基因表达与胃癌分化程度的相关性。对高、中和低分化胃癌组织进行荧光定量PCR、western blot和免疫组织化学染色分析，结果显示，胃癌组织分化程度越高Annexin A3的mRNA和蛋白表达越低，免疫组织化学染色结果也显示，分化程度越高的胃癌组织，Annexin A3的着色越浅，与荧光定量RT-PCR、western blot方法结果一致。以上结果表明，Annexin A3的表达与胃癌分化程度呈负相关，进一步证明了Annexin A3在胃癌病理过程中的重要作用。　　3.Annexin A3基因在不同分化胃癌细胞株中的表达为了进一步研究Annexin A3的表达与胃癌分化程度的相关性的机制研究，我们接着检测了不同分化程度的胃癌细胞株中Annexin A3的表达。其mRNA和蛋白表达量均明显高于对照组正常胃粘膜细胞株GES-1。而通过荧光定量RT-PCR和Western blot检测结果显示，Annexin A3的表达由低到高为:高分化腺癌细胞株MKN-28、中分化腺癌细胞株SGC-7901、低分化腺癌细胞株BGC-823。免疫细胞化学染色分析结果与荧光定量RT-PCR、western blot方法结果一致。　　以上结果表明，Annexin A3基因表达与胃癌细胞株分化程度呈负相关。　　结论:体内胃癌切除标本和体外培养的胃癌细胞中Annexin A3基因表达上调，且其表达水平与癌细胞分化程度呈负相关。　　第二部分、Annexin A3对胃癌细胞增殖的影响　　在很大程度上，肿瘤的发生取决于细胞增殖与细胞死亡之间的平衡，当增殖大于死亡时，肿瘤就可能发生;而死亡大于增殖时，肿瘤则可能缩小甚至消亡。肿瘤细胞的独有的特点是具有无限增殖的能力，第一部分发现Annexin A3在胃癌细胞中的上调，但其表达上调与胃癌的发生之间的关系如何？　　目的:利用低分化胃癌BGC823细胞，在BGC823细胞中下调Annexin A3表达，观察Annexin A3对BGC823细胞增殖的影响及可能机制。　　方法:设计合成的Annexin A3特异性小干扰RNA(AnnexinA3-siRNA)转染BGC823细胞后封闭内源性Annexin A3表达的效果通过western blot检测。借助封闭Annexin A3表达的手段，进一步通过MTT实验观察Annexin A3对BGC823细胞增殖活性的影响。同时通过封闭Annexin A3表达，观察Annexin A3对细胞增殖相关蛋白表达的影响。以荧光定量RT-PCR和Western blot检测。　　结果:　　1.BGC823细胞封闭Annexin A3表达效率的鉴定结果显示，与转染无关序列的NS-siRNA对照组相比，转染了AnnexinA3-siRNA-1、Annexin A3-siRNA-2、Annexin A3-siRNA-3的BGC823细胞Annexin A3的表达量有不同程度下调，其中Annexin A3-siRNA-2转染后对BGC823细胞内源性Annexin A3封闭的效率超过了90％。我们用不同浓度（20 nM、40 nM和80 nM）的Annexin A3-siRNA-2转染细胞，结果显示，BGC823细胞中Annexin A3的表达量随着Annexin A3-siRNA-2浓度的增加而下降。　　2.Annexin A3对BGC823细胞增殖活性的影响结果显示，转染Annexin A3-siRNA-2的BGC823细胞增殖活性呈时间依赖性下降。以上结果提示，Annexin A3具有促进胃癌细胞增殖的作用，抑制Annexin A3的表达可抑制细胞增殖。　　3.Annexin A3对BGC823细胞增殖相关基因表达的影响结果表明，转染Annexin A3-siRNA-2的BGC823细胞其肿瘤促进因子PCNA、Cyclin D1的表达明显下调，肿瘤抑制因子P21和P27的表达则显著上调。可见，Annexin A3具有促进BGC823细胞增殖促进蛋白表达，抑制BGC823细胞增殖抑制蛋白表达的作用。　　结论:综上所述，Annexin A3可通过调控周期相关蛋白的表达影响BGC823细胞周期进程，从而在胃癌细胞的增殖过程中发挥重要作用。　　第三部分、Annexin A3基因对胃癌细胞侵袭能力的影响　　恶性肿瘤恶化的结果便是肿瘤转移，而迁移和侵袭能力增强是转移的基础。研究发现，Annexin家族成员中，Annexin A1、Annexin A2和Annexin A6都可调节细胞迁移。但Annexin A3对胃癌细胞黏附和迁移能力的影响目前尚不清楚。　　目的:利用低分化胃癌细胞株BGC823细胞，借助小干扰RNA手段，在BGC823细胞中下调Annexin A3表达，观察AnnexinA3对低分化胃癌细胞株BGC823细胞侵袭的影响及可能机制。　　方法:通过划痕实验观察了Annexin A3对BGC823细胞水平迁移的影响。肿瘤细胞可穿透基底膜向下浸润，我们进一步利用Transwell侵袭小室模型，实验观察Annexin A3穿透基底膜的侵袭能力。为了深入探讨Annexin A3对BGC823细胞迁移和侵袭影响的分子机制，我们进一步观察封闭Annexin A3表达对BGC823细胞黏附、迁移和侵袭相关分子TIMP-1、TIMP-2、MMP-2、MMP-9基因的表达情况。以荧光定量RT-PCR和Western blot来检测。　　结果:　　1.Annexin A3对BGC823细胞迁移的影响结果显示，转染Annexin A3-siRNA-2的BGC823细胞迁移率则显著下降。以上结果提示，Annexin A3具有促进BGC823细胞迁移的作用，抑制Annexin A3的表达可抑制肿瘤细胞的迁移。　　2.Annexin A3对BGC823细胞侵袭的影响结果显示们，转染Annexin A3-siRNA-2的BGC823细胞侵袭能力显著下降。以上结果提示，Annexin A3具有促进BGC823细胞侵袭的作用，抑制Annexin A3的表达可抑制细胞侵袭。　　3.Annexin A3对BGC823细胞迁移和侵袭相关分子表达的影响结果显示转染Annexin A3-siRNA-2的BGC823细胞TIMP-1和TIMP-2的表达明显上调，MMP-1和MMP-2的表达显著下降。可见，Annexin A3具有上调促进迁移侵袭的MMP-1和MMP-2在BGC823细胞中的表达，同时下调抑制迁移侵袭的TIMP-1和TIMP-2在BGC823细胞中的表达。　　结论:Annexin A3可通过上调MMP-1和MMP-2的表达，下调TIMP-1和TIMP-2的表达影响BGC823细胞迁移和侵袭过程。