论文部分内容阅读
目的: 1.观察呼吸道合胞病毒(RSV)感染后,人支气管上皮(HBE)细胞12h、24h、48h过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)和叉头框蛋白A2(FOXA2)mRNA、表皮生长因子(EGFR)mRNA表达和p-EGFR、EGFR蛋白比值、黏蛋白(MUC5AC)蛋白水平的变化。探讨 RSV感染后,气道黏液高分泌的调控作用。 2.观察PPAR-γ激动剂罗格列酮和PPAR-γ拮抗剂(GW9662)及EGFR抑制剂(AG1478)干预后RSV感染HBE细胞PPAR-γ和FOXA2 mRNA表达、EGFR mRNA表达、p-EGFR/EGFR蛋白比值及MUC5AC蛋白水平的变化,探讨罗格列酮干预对RSV感染气道黏液高分泌的抑制作用及其机制。 方法: 1.将HBE细胞传代培养,待细胞生长至80%-90%左右时,于96孔板中配制100μL的HBE细胞悬液,培养板预培养24h(在37℃,5%CO2),向培养板加入10μL的10-50μmol/L的罗格列酮、GW9662及AG1478及0.1%DMSO。将培养板分别孵育12h、24h及48h,向每孔加入10μL CCK-8溶液。在培养箱内孵育1-4h后,用酶标仪测定450nm吸光度。 2.建立RSV感染的体外HBE细胞模型,将HBE细胞传代培养,待细胞生长至80%-90%左右时,按每孔2*105传代于六孔板中,随机分成6组:A组(AG1478+RSV组)、B组(罗格列酮+RSV组)、C组(GW9662+RSV组)、D组(RSV组)、E组(0.1%DMSO+细胞组)、F组(细胞对照组)。RSV感染HBE细胞造模前2h,A组予AG1478(10μmol/L)预处理,B组予罗格列酮(10μmol/L)预处理,C组予GW9662(10μmol/L)预处理。A-D组以100TCID50 RSV感染吸附HBE细胞2h后加维持液继续培养,各组分别培养至12h、24h、48h,收获细胞及上清液进行检测。 3.实时荧光定量RT-PCR检测上述3个不同时间点各组EGFR、PPAR-γ、FOXA2 mRNA表达情况,Western Blot方法检测p-EGFR及EGFR蛋白水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清液中MUC5AC蛋白。 结果: 1.病毒滴度测定: 本实验RSV的TCID50为10-4.4/50μl,病毒攻击量为100TCID50。即10-2.4/50μl。 2.罗格列酮、GW9662、AG1478及0.1%DMSO的细胞毒性: 10μmol/L罗格列酮、10μmol/L GW9662和10μmol/L AG1478及0.1%DMSO处理后三个时间点(12h、24h、48h)HBE细胞存活率分别99.0%、98.8%、98.0%;99.6%、98.6%、98.2%;100.2%、98.6%、98.2%,和99.6%、98.8%、98.1%与细胞对照组相比差异无统计学意义(均P>0.05),表明上述浓度的药物对HBE细胞无毒性作用。 3. RSV感染及罗格列酮、GW9662、AG1478干预后PPARγmRNA表达变化: E、F组PPARγ仅少量表达,E组与F组相比,同一时间点PPARγmRNA表达量相近,差异无统计学意义,提示0.1%的DMSO对PPARγmRNA表达量无影响。与F组相比,A组、B组、D组PPARγmRNA表达量均有所增加(均P<0.05),且随时间增加。A组、B组表达量逐渐增加,于48h达高峰,但D组表达量逐渐减少;C组表达量最少。B、C、D组差异有统计学意义(均P<0.05);三个时间点B组表达量均明显高于D组,差异有显著统计学意义(P<0.05)。 4. RSV感染及罗格列酮、GW9662、AG1478干预后EGFR mRNA表达变化: E、F组EGFR mRNA表达量最少,E组与F组相比,同一时间点表达量相近,差异无统计学意义,与F组相比,三个时间点的A组、B组、C组、D组表达量均有增加(均P<0.05),且随时间增加,48h达到最高;三个时间点均以D组表达量最高;与D组相比,A组、B组EGFR mRNA表达量明显降低(均P<0.05)。 5.RSV感染及罗格列酮、GW9662、AG1478干预后FOXA2 mRNA表达变化: E、F组FOXA2呈高表达,E组与F组相比,同一时间点表达量相近,差异无统计学意义,与F组相比,三个时间点A组、B组、C组、D组表达量均有降低,随时间逐渐升高,其中D组表达量最低(均P<0.05)。与D组相比,A组、B组的表达量明显升高(均P<0.05)。 6.RSV感染及AG1478、罗格列酮、GW9662干预后MUC5AC蛋白的表达变化: E、F组表达量最少,E组与F组相比,同一时间点表达量相近,差异无统计学意义;与F组相比,三个时间点A组、B组、C组、D组表达量均明显增加(均P<0.05),且随时间增加而增加,在48h达高峰,其中D组表达量最高;与D组相比,三个时间点上A组、B组表达量均有降低(除12h的A组P>0.05外,均P<0.05);相较于A组,B组表达量降低更明显(P<0.05)。 7. RSV感染及AG1478、罗格列酮、GW9662干预后p-EGFR/EGFR蛋白比值变化: E、F组比值最低,E组与F组相比,同一时间点差异无统计学意义;与F组相比,三个时间点的A组、B组、C组、D组比值均明显增加(均P<0.05),且随时间增加而增加,在48h达到最高,其中D组比值最高;与D组相比,A组、B组蛋白量比值均明显降低(均P<0.05)。 结论: 1. RSV感染后MUC5AC蛋白表达增加,表明RSV感染可引起气道黏液高分泌;同时PPAR-γ及EGFR表达增加、FOXA2表达减少,表明PPAR-γ、EGFR-FOXA2信号通路参与RSV感染后气道黏液高分泌过程。 2. EGFR抑制剂干预后,可明显降低RSV感染后p-EGFR/ EGFR的蛋白比值及MUC5AC蛋白水平,FOXA2 mRNA的表达增加。证实EGFR通过抑制FOXA2的表达,参与RSV感染气道黏液高分泌过程。而EGFR抑制剂可上调FOXA2基因的表达,从而起到抑制气道黏液高分泌的作用。 3.罗格列酮干预可促使RSV感染后PPAR-γmRNA表达增加,同时抑制EGFR mRNA表达和p-EGFR蛋白水平的升高,增加FOXA2 mRNA表达,从而抑制MUC5AC蛋白水平的增加;而使用PPAR-γ拮抗剂可逆转罗格列酮的上述作用,证实罗格列酮通过EGFR-FOXA2信号通路发挥抑制气道黏液高分泌作用。