手足口病(hand,foot,mouth disease, HFMD)是以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹、疱疹为特征的儿童常见病。绝大部分病情较轻,少数可发生严重神经系统并发症并致相当数量儿童死亡,是中国及亚洲的主要公共卫生问题之一。HFMD由人类肠道病毒(human enterovirus, HEV)感染引起。其中肠道病毒71型(EV71)是最重要的病原体,因其更易导致神经系统感染甚至死亡。EV71属小RNA病毒科,成熟EV71病毒颗粒外壳由60个拷贝的P1蛋白组成,P1又分为VP1-VP4四种衣壳蛋白。按照VP1区不同EV71分A、B、C三个基因亚型,中国大陆流行C4亚型。临床实验室HFMD病原学诊断以分子生物学和血清学检测为主。目前,尚无有效的抗病毒药物和疫苗防治EV71感染。对于EV71外壳抗原结构、中和性表位及其在病毒致病机制中的作用的认识还很有限。已证实VP1、VP2、VP3具中和活性抗原位点,VPl是最主要的抗原决定簇,VP4虽位于病毒表面内侧,但能产生相应抗体,推测其可能参与抗体依赖感染增强效应(ADE)而加强病毒对机体的攻击。本研究对广东地区发生的HFMD进行病原学监测：收集了2009-2011年EV71流行株及所致疾病的临床特征、基因分型及其来源、变迁及突变等信息,为控制和预防HFMD提供预警及对策的参考资料；采用多种目前实验室检测病毒的方法对临床常用的捕获ELISA发检测抗EV71-IgM用于EV71病原诊断进行评估,使临床更合理使用；在此基础上,采用载体pQE30a和大肠杆菌M15系统重组表达了EV71临床分离株的VP1-4蛋白,通过免疫小鼠获得针对这些蛋白的单克隆抗体,为研究EV71病毒衣壳的抗原结构及功能、揭示EV71致病机制以及疫苗制备提供实验依据。本研究包含三个部分内容：第一部分2009-2011年EV71致手足口病临床及病原学特征2009～2011年来自广东各地在我院就(转)诊的临床诊断HFMD(含疱疹性咽峡炎)分别有107、553、579例,实时荧光RT-PCR对肠道病毒通用型核酸检出率分别为87.9%(94/107)、91.2%(505/553)和88.8%(515/579),EV71占所有病原的比例分别为28.1%(30/107)、45.6%(252/553)和38.7%(221/579),显示EV71仍为广东手足口病最主要病原。1239例患者中男性813例,女性426例,男女比1.91,EV71感染性别比与全部EV感染无差异(P=0.765)。患者年龄最小1个月,最大35岁,中位数分别是2.08岁、2.58岁和2.41岁；1岁和2岁是发病最多的两个年龄段,占73.24岁以下儿童占患者总数85.0%；6个月以下发病者21例,EV71感染8例；各年龄段感染EV71与EV感染比例相似。诊断为重症手足口病81例,年龄最小4个月,最大10岁,中位数2.0岁,1～2岁是出现重症最多的年龄段,各年龄段发生重症手足口病例与普通手足口病例相似；男女比：2.24:1,略(?)性别比,但无统计学差异(P=0.62),提示重症并不倾向于男孩。监测显示2009-2011年广东以散发流行为主。每年出现两个发病高峰：初夏(5、6月间)和秋季(10、11月),2010年5月中旬达最高峰,持续约1个月,10月出现小高峰；2011年发病高峰期推迟至半个月,春夏季EV71导致的HFMD较秋季略高。临床表现以手掌、臀部、足底斑疹,口腔疱疹为主：90%上的(?),60%以上发病初期有发热伴出疹,顺序不一。少数(7.2-11.3%)表现呼吸道感染症状。极少数出现神经性症状,如呕吐、抽搐、惊跳或头痛等。EV71感染临床表现与EV所致HFMD相似,无统计学差异。2010～2011年分别有89和144例患儿经ICU治疗,其中EV感染分别是75例(14.9%)和128例(24.9%)。EV71感染较EV感染更多需要ICU治疗(P值分别为0.037和0.000)。所有诊断为重症手足口病者均有肠道病毒相关性脑病发生,如病毒性脑炎等,呼吸道并发症主要是神经源性肺水肿。扩增测序33株2009-2010年临床分离EV71(2009年5株,2010年28株)的部分VP1区,经比对分析,确定均属C4a亚型,与广东历年分离毒株序列比较未见明显差异；与2008年阜阳EV71流行株比较亦未见明显差异,表明为国内循环流行株；与台湾近年流行株的基因亚型不同,表明两岸毒株进化来源不同。通过Clustal W软件对临床分离株与标准株BrCr(U22521).台湾1998年流行株(Taiwan98)比对VPl区序列：核苷酸相似度93.7%-100%,氨基酸相似度97.0%-100%。第22、98号位氨基酸与台湾98年流行株和标准株BrCr略有不同。第二部分实时荧光RT-PCR和EV71-IgM捕获ELISA法对EV71致手足口病诊断的评估为评估捕获ELISA (?)法检测EV71-IgM,我们收集了从发病第1天到158天的134例EV71感染血清256份,发现发病第1天即可检出EV71-IgM,随发病天数增多检出率升高,第5天达100%；发病3个月后血清EV71-IgM检出率明显下降。急性期(发病7天的(?)检测敏感度90.2%(138/153),发病90天内敏感度93.6%(233/249)。与CA16-IgM检测存在交叉反应。实验显示122份CA16感染血清中38份EV71-IgM阳性,49份其它肠道病毒感染血清中14份EV71-IgM阳性,105份其它呼吸道病毒感染血清有2份(来自同一呼吸道合胞病毒A和B型双重感染患者)EV71-IgM阳性对于其它肠道病毒,EV71-IgM捕获法ELISA法检测特异性为69.6%(52171.95。95(?):65.2-72.4%),对于其它呼吸道病毒特异性98.1%(2/105,950%可信区间：96.5-99.5%),检测阳性预测值81.3%(95%可信区间：76.9-85.1%),阴性预测值91.0%(95%可信区间：87.5-93.8%)。206份EV71感染血清检出EV71-IgM阳性199份(95.7%)、CA16-IgM阳性58份(28.2%),其中EV71-IgM的OD值高于CA16-IgM者56份(占96.6%)；119份CA16感染血清CA16-IgM阳性83份(69.7%),EV71-IgM阳性36份(30.3%),其中CA16-IgM的OD值高于EV71-IgM者33份(占91.7%),实际感染的病原产生的IgM检测OD值更高,可正确区分大部分感染病原体。111例同日收集的肛拭子和血清标本分别用ELISA和实时荧光RT-PCR两种方法检测,发现两种方法诊断EV71感染无显著性差异(McNemar’s χ2检验P=0.648),一致性较好(Kappa值0.729)。第三部分EV71病毒衣壳蛋白P1单抗的制备依据EV71基囚序列信息(FJ194965.1)设计VP1～VP4基因全长序列引物,经PCR扩增,Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切PCR产物,连接载体pQE30a,经测序确认与原始序列完全一致后将该重组质粒转化大肠杆菌M15。经诱导表达VP1～VP4蛋白,均以包包涵体形式存在,以8M尿素变性及梯度复性,复性蛋白经HisBind Resin层析柱纯化.获得纯化VP1～4蛋白。以重组VP4蛋白与纯化EV71病毒交替免疫小鼠,经小鼠脾细胞与杂交瘤细胞融合获得杂交瘤细胞克隆,分别采用重组蛋白VP1～4和病毒液包被ELISA、间接免疫荧光法筛选克隆,采用免疫印迹鉴定针对的靶蛋白。以FV71病毒液、溶于8M尿素的重组蛋白VP1、VP2和VP4分别包被板条,ELISA检测融合细胞克隆上清,挑选OD值高的克隆,进一步间接免疫荧光法对EV71感染和未感染RD细胞反应,筛选仅对EV71感染RD细胞有阳性荧光的克隆。克隆上清采用纯化EV71病毒液和重组VP1-VP4蛋白经SDS-PAGE胶分离的蛋白组分进行免疫印迹反应鉴定抗体针对的靶蛋白。初步获得25株针对P1蛋白的单抗：6株针对EV71病毒VP1蛋白(天然蛋白),其中4株对重组VP1蛋白有反应；3株仅针对重组VP2蛋白;2株针对病毒VPl和VP2蛋白,其中针对重组VP1和VP2各一株；1株针对重组蛋白VP4；另有13株目前尚未鉴定出针对的靶蛋白。小结根据以上三个部分的研究成果,本研究小结如下：1.2009-2011年监测EV感染手足口病患者病原,EV71感染分别是：30、252和221例,分别占28.1%(30/107)、45.6%(252/553)和38.7%(221/579),EV71仍为广东手足口病最主要病原。2.2009-2011年广东以散发为主,每年出现一大一小两个发病高峰,即初夏(5、6月之间)和秋季(10、11月)；1、2岁是发病最多的年龄段,占73.2%,4岁以下儿童占总数85.0%；EV71感染致重症手足口病患者年龄分布与此相似,无统计学差异。3.2009～2010年广东EV71临床分离株属C4a亚型,与广东历年分离株和08年安徽阜阳流行株序列比较未见差异,为国内循环流行毒株；与台湾近年流行株比较,为不同基因亚型,提示两地毒株进化来源不同；与标准株BrCr、台湾1998年流行株Taiwan98VP1区核苷酸相似度93.7%-100%,氨基酸相似97.0%-100%。第22、98号位氨基酸于台湾98年流行株和标准株BrCr略有不同。4.捕获ELISA法EV71-IgM检测诊断EV71致手足口病急性期敏感度为90.2%(138/153),特异性分别为69.6%(52/171,相对其他肠道病毒)和98.1%(2/105,相对其他呼吸道病毒),检测阳性预测值81.3%(95%可信区间：76.9-85.1%),阴性预测值91.0%(95%可信区间：87.5-93.8%)。与实时荧光RT-PCR方法诊断EV71感染无显著性差异(McNemar’s χ2检验P=0.648),一致性较高。该方法适用于临床。5.捕获ELISA法EV71-IgM检测诊断EV71虽然对CA16感染HFMD血清有交叉反应性(28.2%和30.3%),但较高的OD值可以反映感染病毒的类型。6.采用EV71纯化病毒和重组VP4蛋白免疫小鼠,初步获得25株针对P1蛋白的单克隆抗体,经EV71病毒液、VP1-VP4重组蛋白ELISA、间接免疫荧光筛选和免疫印迹鉴定分别是：针对VP1蛋白6株,VP2蛋白3株、同时针对VP1和VP22株和VP4蛋白1株,尚未确定13株。