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第一部分脊柱结核外周血淋巴细胞特异性circRNAs的筛选及验证研究研究背景:脊柱结核(STB)发生率较高,而我国是脊柱结核发病率较高的国家之一,仅次于印度。脊柱结核最常见的表现是慢性腰背痛,因为脊柱结核的诊断很容易被忽视,结果经常导致患者神经功能的损害和脊柱骨质畸形的发展。且由于多重耐药结核菌株的逐渐增多,给结核病的治疗带来了巨大的挑战。目前对于脊柱结核疾病,第一线治疗仍是抗结核药物治疗,外科手术干预适用于对药物治疗无反应的神经源性的减压、脊柱稳定性的恢复和畸形的矫正。因为脊柱结核严重影响患者的生活质量,并加重社会的经济负担,因此,寻找特异性的诊断标志物和了解其详细的发病机制,对于疾病早期诊断和治疗具有重要意义。但是,关于脊柱结核的详细发病机制还尚未清楚。目前,随着生物信息学的不断发展,我们发现许多非编码RNA可以参与疾病的病理发展过程,基因间相互调节、相互联系、相互制约调控着脊柱疾病的发生。已有文献报道非编码RNA在结核病的发病机理当中起着重要的作用,但其在脊柱结核疾病发病机理的参与机制还尚未见报道。近年来随着基因组学的快速发展,人类不断的发现非编码RNA在各种疾病的发病机制中发挥了关键的作用,例如脑、肺癌、结肠癌、退行性膝关节炎等疾病。在功能上,微小RNA(miRNA)通过碱基配对的原则与mRNA结合,从而导致mRNA的降解或阻碍其翻译。近年的研究表明,环状RNA(circRNA)在细胞质中分布广泛,且序列保守,具有一定的组织、时序及疾病特异性,并且circRNA分子富含miRNA的结合位点,能与miRNA竞争性结合,调节与miRNA介导调节相关的靶基因水平,使其表达增加,这种作用机制被称为竞争性内源RNA(ceRNA)调控机制。通过与疾病相关的miRNA相互结合并影响靶基因的表达,circRNA在疾病中调节中发挥着间接调控作用。为此,我们尝试从脊柱结核患者的外周血当中寻找特异性的circRNA,以及寻找构建circRNA-miRNA-mRNA调控网络,对疾病的发病机制、早期诊断、预后疗效提供有效的帮助。因此,研究上述外周血淋巴细胞中的特异性circRNA,将有助于脊柱结核发病机制的全面揭示。研究目的:脊柱结核是骨科在临床上常见的多发病,早期的诊断及治疗对脊柱结核的预后十分重要。目前脊柱结核在诊断依据主要依靠症状体征、实验室检查及影像学检查。但是在疾病的早期,典型的临床症状、实验室检查及影像学缺乏特异性,导致临床医师的诊断困难或出现误诊、漏诊情况。所以,我们此次研究的目的是研究筛查特异性的circRNA,探寻对脊柱结核有潜在诊断价值的特异循环circRNA标记物。研究方法:本研究以美国的Arraystar公司的人类circRNA表达谱进行聚类分析。本研究采用两阶段病例-对照研究设计。第一阶段是初筛阶段,收集新发脊柱结核淋巴细胞和健康成人淋巴细胞共25对样本,随机分别选取3对病例,利用circRNA芯片检测淋巴细胞中circRNA表达谱,依据表达量差异倍数(fold change,FC)≥1.2倍,P<0.05为筛选标准,筛选差异表达的circRNAs,。第二阶段是独立验证阶段,分别收集新发脊柱结核淋巴细胞和健康成人淋巴细胞样本25对,采用RT-PCR技术,对初筛阶段筛选出的候选circRNAs进行验证研究。研究结果:通过circRNA基因芯片初步筛选出89个差异表达的circRNAs,其中46个表达上调,43个表达下调。所挑选的在脊柱结核患者中的上调和下调差异表达差异倍数最大的各4条circRNA进行RT-PCR(实时荧光定量PCR)验证结果显示,与健康成人相比,脊柱结核患者中hsacircRNA100632表达上调。hsacircRNA400770、hsacircRNA403882表达下调,与芯片检测结果一致。研究结论:1.在本实验当中鉴定出在脊柱结核外周血淋巴细胞中circRNA的表达谱,存在89个circRNA表达差异,其中46个circRNA表达上调,43个circRNA表达下调。2.运用RT-PCR技术,验证了hsacircRNA100632在实验组中表达升高,hsacircRNA400770、hsacircRNA403882在实验组表达降低。第二部分脊柱结核相关circRNAs的功能预测分析及分子调控网络分析研究背景:circRNA具有“miRNA海绵体”效应或可以作为竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)与miRNA结合而抑制其活性,从而调控miRNA靶基因的表达,影响人体正常的生理功能,与多种疾病的发生发展有关。本次研究利用生物信息学分析策略,对差异表达的circRNAs进行功能预测,探讨其在脊柱结核发病中的作用机制。研究目的:利用生物信息学方法,构建以circRNA为核心的circRNA-miRNA调控作用网络,呈现了circRNA-miRNA二者在脊柱结核分子间的调控关系,对其发病机制进行初步探索,同时也为其他疾病的同类研究提供思路。研究方法:对第一部分采用circRNAs芯片筛选的脊柱结核淋巴细胞circRNAs差异表达谱,通过使用注释及可视化数据库(the Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID)对差异circRNA相关基因进行基因本体论(Gene Ontology,GO)及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes,KEGG)分析,预测靶基因的相关功能及信号通路。通过TargetScan,miRanda的自制miRNA靶标预测软件预测circRNA-miRNA相互作用,构建circRNA-miRNA调控网络。研究结果:GO分析结果显示,在脊柱结核淋巴细胞差异表达的circRNAs中,富集最大的生化过程(BP)主要涉及细胞对DNA损伤刺激的反应(cellular response to DNA damage stimulus),肽酰丝氨酸磷酸化(peptidyl-serine hosphorylation),DNA修复(DNA repair),(protein ubiquitination),NF-κB转录因子活性的正调节(positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity),DNA损伤应答(DNA damage response),p53类介质的信号转导导致细胞周期停滞(signal transduction by p53 class mediator resulting in cell cycle arrest),蛋白质磷酸化(proteinphosphorylation)。细胞成分(CC)主要涉及颜色体(chromatin),核质(nucleoplasm),细胞质(cytoplasm),中心体(centrosome),细胞膜(membrane),卵裂沟(cleavage furrow),粘着斑(focal adhesion),板状伪足(lamellipodium),Cul3-RING泛素连接酶复合物(Cul3-RING ubiquitin ligase complex),胞质溶胶(cytosol)。分子功能(BF)泛素-蛋白质转移酶活性(ubiquitin-protein transferase activity),激酶活性(kinase activity),ATP结合(ATP binding),染色质结合(chromatin binding),蛋白结合(protein binding)。KEGG通路分析结果显示,Epstein-Barr virus infection,Pancreatic cancer,Sphingolipid signaling pathway信号途径与差异circRNAs有关。单个circRNA与多个miRNAs有匹配的结合位点。研究结论:1.circRNAs参与脊柱结核相关信号通路,可以结合多个脊柱结核相关miRNAs,参与脊柱结核的发生和发展过程。2.在本实验当中差异表达的circRNA相关靶基因进行KEEG通路分析,可以得出3条脊柱结核发病的可能调节通路,深度挖掘了上述3条调控通路对脊柱结核的病理机制的发展可能起到助推作用。